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Aug 16, 2023

Nature Methods Band 20, Seiten 1183–1186 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Open-3DSIM ist eine Open-Source-Rekonstruktionsplattform für die dreidimensionale strukturierte Beleuchtungsmikroskopie. Wir demonstrieren seine überlegene Leistung bei der Artefaktunterdrückung und der High-Fidelity-Rekonstruktion im Vergleich zu anderen Algorithmen an verschiedenen Proben und über einen Bereich von Signal-Rausch-Werten. Open-3DSIM bietet auch die Möglichkeit, die Dipolorientierung zu extrahieren und ebnet so einen neuen Weg zur Interpretation subzellulärer Strukturen in sechs Dimensionen (xyzθλt). Die Plattform ist als MATLAB-Code, als Fiji-Plugin und als Exe-Anwendung verfügbar, um die Benutzerfreundlichkeit zu maximieren.

Die strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (SIM) ist die am häufigsten eingesetzte hochauflösende Modalität in den Biowissenschaften, da sie eine schnelle Längsbildgebung mit geringer Phototoxizität bietet und in hohem Maße mit der Fluoreszenzmarkierung kompatibel ist1,2,3. Mit dem Aufschwung von SIM wurden verschiedene Open-Source-Rekonstruktionsalgorithmen entwickelt, wie z. B. OpenSIM4, fairSIM5, SIMtoolbox6, HiFi-SIM7 und so weiter. Die Verfügbarkeit von Open-Source-Software fördert auch maßgeschneiderte SIM-Hardwareplattformen wie SLM-SIM8, DMD-SIM9, Galvanometer-SIM10, Hessian-SIM11 und so weiter. Durch die Kombination von Software und Hardware ist eine offene und produktive Community für SIM-Forscher entstanden.

Im Vergleich zu 2DSIM verdoppelt 3DSIM die Auflösung entlang der z-Achse1,12,13,14 sowie in der xoy-Ebene. 3DSIM-Rekonstruktionsalgorithmen finden sich in kommerziellen Systemen wie GE OMX und Nikon N-SIM oder in Open-Source-Software wie Cudasirecon1, AO-3DSIM14, SIMnoise15 und 4BSIM16. Allerdings sind die kommerziellen Lösungen auf bestimmte Mikroskopieplattformen beschränkt. Bei den Open-Source-Lösungen handelt es sich allesamt um zielspezifische Werkzeuge zur Lösung bestimmter Bildgebungsprobleme und sie sind für die generische 3DSIM-Rekonstruktion ungeeignet. Sie können auch zu schwerwiegenden Artefakten führen oder die Benutzerfreundlichkeit beeinträchtigen. Im Gegenteil, im Bereich 2DSIM oder Single-Layer-3DSIM erklärt OpenSIM4 das Prinzip der SIM-Rekonstruktion systematisch; fairSIM5 integriert den Algorithmus in Fidschi, um die Nutzung durch biologische Forscher zu erleichtern; HiFi-SIM7 optimiert die Rekonstruktionsergebnisse deutlich und verfügt über eine benutzerfreundliche grafische Benutzeroberfläche. Das Fehlen praktischer mehrschichtiger 3DSIM-Software erschwert den Benutzern den Zugriff und die Nutzung, und schwerwiegende Artefakte gefährden die Wiedergabetreue und Zuverlässigkeit von 3DSIM. Daher wird im 3DSIM-Bereich dringend ein gut etabliertes und benutzerfreundliches 3DSIM-Rekonstruktionstool benötigt, um dessen Weiterentwicklung sicherzustellen.

Um diesem Bedarf gerecht zu werden, berichten wir hier über Open-3DSIM, das eine überlegene und robuste mehrschichtige 3DSIM-Rekonstruktion ermöglichen kann. Wir bereiten die Fidschi-Version vor, um sie für biologische Nutzer leicht zugänglich zu machen; Bereitstellung von Zwischenergebnissen, um Hardware-Spezialisten dabei zu helfen, ihre selbst erstellten 3DSIM-Daten zu überprüfen und modulare Quellcodes für Softwareentwickler zu öffnen, um ihre zukünftigen Entwicklungen voranzutreiben. Durch Vergleiche mit verschiedenen Algorithmen an verschiedenen Proben und Signal-Rausch-Werten (SNR) zeigen wir, dass Open-3DSIM aufgrund der Optimierung der Parameterschätzung und Spektralfilterung eine überlegene Leistung bietet, was zu hochauflösenden Rekonstruktionen mit minimalen Artefakten führt schwache Informationen erhalten. Darüber hinaus kann Open-3DSIM die inhärenten Informationen zur Dipolorientierung extrahieren und so das volle Potenzial von 3DSIM in der Mehrschicht-, Mehrfarben-, Polarisations- und Zeitraffer-Rekonstruktion mit Superauflösung erschließen.

Das Prinzip von Open-3DSIM ist in der ergänzenden Abbildung 1 und der ergänzenden Anmerkung 1 dargestellt. Das Muster der dreidimensionalen (3D) strukturierten Beleuchtung17 wird durch die Interferenz von drei Strahlen durch Gitterbeugung erzeugt. Anschließend werden 3D-Stapeldaten Schicht für Schicht erfasst, in den Frequenzbereich umgewandelt und durch eine Phasentrennungsmatrix getrennt. Die getrennten ±ersten Frequenzkomponenten werden verschoben, um den Leckkegel der Nullfrequenzkomponente zu füllen, und die ±zweiten Frequenzkomponenten werden verschoben, um den Spektralbereich der xoy-Ebene zu erweitern. Daher verdoppelt 3DSIM den Spektralbereich im Vergleich zum Weitfeld, indem es den „fehlenden Kegel“ in einer optischen Konvertierungsfunktion (OTF) füllt (Extended Data Abb. 1 und Ergänzende Anmerkungen 1 und 2) und 3D-Ergebnisse mit Superauflösung erhält.

Wir verwenden die Kreuzkorrelationsmethode5,7, um die Frequenz, den Winkel, die Phase und die Modulationstiefe der strukturierten Beleuchtungsmuster abzuschätzen, um die Einbeziehung von Anfangsparametern zu vermeiden, die andere 3DSIM-Algorithmen zur Eingabe benötigen1,14,15,16. Um einen korrekten Frequenzparameter zu erhalten, was der erste Schritt der Parameterschätzung ist, verwenden wir sowohl +erste als auch +zweite Frequenzkomponenten. Obwohl die Schätzung der Spitze der +zweiten Frequenz traditionell genauer ist als die der +ersten, weist die Spitze der +ersten Frequenz bei niedrigem SNR einen höheren Kontrast auf als die +erste Frequenz, wie in Abb. 1a dargestellt. Daher haben wir ein Kriterium aufgestellt, um zu bestimmen, ob die Schätzung über die Spitze der +zweiten Frequenz zuverlässig ist. Wenn nicht, verwenden wir stattdessen das erste Spektrum zur Schätzung, um die Gültigkeit der Frequenzschätzung zu gewährleisten. Dann können die entsprechenden Parameter wie Phase und Winkel genau aufgelöst werden. Diese Methode kann die Korrektheit der Parameterschätzung bei der Rekonstruktion von Bildern mit niedrigem SNR erheblich verbessern und so verschiedene Artefakte reduzieren, die durch Fehler bei der Parameterschätzung verursacht werden17,18.

a: Getrennter Frequenzbereich und Bild bei niedrigem SNR, was zeigt, dass der erste Frequenzpeak höher als der zweite ist und leichter zu erkennen ist. Oben links, oben rechts und unten links sind die getrennten nullten, ersten und zweiten Frequenzbereiche. Unten rechts ist das Rohbild von Aktinfilamenten in U2OS bei extrem niedrigem SNR, aber das erste Muster (sichtbar aufgrund der relativ niedrigen Frequenz) ist leicht zu erkennen. Die Farbbalken in der oberen rechten Ecke von a haben das Format „Intensität (au)“. b, Zweistufiger Filter, der von OTF, Notch, OTFnotch und Apo entwickelt wurde, um das Frequenzspektrum von 3DSIM zu optimieren und so Artefakte zu reduzieren und die Auflösung zu verbessern. Die weißen Linien unten stellen die entsprechenden Profile entlang der geschätzten Häufigkeit dar. c, Rekonstruktionsergebnisse von Aktinfilamenten in U2OS, einschließlich des Vergleichs des Einzelschichtalgorithmus (HiFi-SIM), des Mehrschichtalgorithmus (Open-3DSIM), des Weitfeldbilds (WF) und des polarisierten Open-3DSIM-Bilds (pOpen). . Die Farbbalken in „pOpen“ von c haben das Format „Winkel (rad)“. Maßstabsbalken, 2 μm. Maßstab auf der Z-Achse, 12 Schichten, 0,125 μm pro Schicht. Die Experimente wurden dreimal unabhängig voneinander mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

Als nächstes haben wir entsprechend dem geschätzten Frequenzvektor in der xoy- und yoz-Ebene einen zweistufigen Filter im Frequenzbereich entworfen, der auf dem Notchfilter (Notch), der Apodisierungsfunktion (Apo), OTF und OTFnotch basiert. Zunächst haben wir einen Notchfilter entworfen, der der geschätzten Frequenz und der Eingabebildgröße entspricht, um die Kompatibilität verschiedener Bilder zu verbessern. Wir zeigen, dass die Zusammenarbeit von Filter 1 und Filter 2 dazu führt, dass sich das 3D-Spektrum dem idealen Spektrum annähert, glatt und gleichmäßig ist18,19, was die Spitze des Spektrums unterdrücken, das Rauschen reduzieren und hochfrequente Unschärfen kompensieren kann (Abb. 1b, Erweiterte Daten Abb. 1 und Ergänzende Anmerkung 1 und 2). Diese Methode zur Korrektur eines abnormalen Spektrums ist wichtig, um die Artefakte rekonstruierter Bilder zu kontrollieren und die 3D-Auflösung weiter zu verbessern, sodass sie bei niedrigem SNR eine gute Leistung erbringt. Wir veranschaulichen sorgfältig die Funktion und Überlegenheit der Spektrumfilter (Erweiterte Daten, Abb. 2 und Ergänzende Anmerkung 3) und bieten eine Anleitung zum Anpassen der Parameter (Erweiterte Daten, Abb. 3 und Ergänzende Anmerkung 4).

Abbildung 1c zeigt die 3DSIM-Bildgebung von Aktinfilamenten in U2OS. Open-3DSIM kann die xyz-Auflösung im Vergleich zu Weitfeldbildern verbessern. Darüber hinaus kann Open-3DSIM, das die gesamte Aktinstruktur interpretiert, Defokussierung und Artefakte mit einer Verbesserung der Z-Achse im Vergleich zur einschichtigen Rekonstruktion, genau wie HiFi-SIM, erheblich beseitigen (Extended Data Abb. 4, Ergänzende Anmerkung 5). Wir führen auch die Polarisationsdimension auf der xoy-Ebene ein, um die Bildgebung der Dipolorientierung in Open-3DSIM20,21 zu realisieren. Die Informationen zur Dipolorientierung des analysierten Aktinfilaments sind in Abb. 1c dargestellt. Die Parallelität zwischen Dipolorientierung und Aktinfilamentrichtung bestätigt die Richtigkeit der Polarisationsinformationen.

Um die Leistung von Open-3DSIM weiter zu testen, führen wir zunächst die Simulation mit einer blütenblattförmigen Struktur und einer 3D-Auflösungsteststruktur durch und erzielen so Ergebnisse mit hoher Wiedergabetreue ohne erkennbare Artefakte (Extended Data Abb. 5 und Ergänzende Anmerkung 6). Wir vergleichen Open-3DSIM auch mit herkömmlichen Wenier-basierten 3DSIM-Rekonstruktionsalgorithmen wie AO-3DSIM und 4BSIM und stellen fest, dass Open-3DSIM diese im Vergleich zu ihren gut angepassten rekonstruierten Ergebnissen übertrifft (Extended Data Abb. 6 und Ergänzende Anmerkung 7). Da SIMnoise den Wenier-basierten Filter optimiert, vergleichen wir die Rekonstruktionsergebnisse von Open-3DSIM, OMX und SIMnoise unter Gradienten-SNR für Aktinfilamente in U2OS in Abb. 2a. Hier übertrifft Open-3DSIM OMX und SIMnoise in verschiedenen SNR-Stufen mit weniger Artefakten und Hintergründen. Außerdem sind der mittlere absolute Fehler (MAE) und das SNR von Open-3DSIM nahezu identisch mit denen anderer Algorithmen mit höheren Beleuchtungsbedingungen in Abb. 2b, was die hervorragende Leistung von Open-3DSIM bei niedrigem SNR beweist. Obwohl SIMnoise die Rekonstruktion bei niedrigem SNR optimiert hat, zeigt Open-3DSIM im Vergleich zum aktuellen Ergebnis von SIMnoise in Abb. 2c eine bessere Beibehaltung der Kanteninformationen und einen Entrauschungseffekt bei kürzerer Rekonstruktionszeit. In ähnlicher Weise verfügt Open-3DSIM im Vergleich zu OMX über eine hervorragende Fähigkeit, Artefakte zu entfernen und schwache Informationen beizubehalten (Abb. 2d). Weitere Vergleiche der Rekonstruktion auf dem fluoreszierenden quantitativen Standardblatt (Argolight) und verschiedenen biologischen Proben sind in den erweiterten Datenabbildungen zu sehen. 7 und 8 sowie die Ergänzenden Anmerkungen 8 und 9, um die hervorragende Leistung von Open-3DSIM weiter zu beweisen.

a, Rekonstruktion für Aktinfilamente unter verschiedenen Beleuchtungsbedingungen von extrem niedrig (EL, Intensität von 2 %, Belichtungszeit von 5 ms), niedrig (L, 5 %, 5 ms), mäßig (M, 10 %, 20 ms) und hoch (H, 10 %, 50 ms) beim Vergleich zwischen SIMnoise, OMX und Open-3DSIM. b, MAE unter verschiedenen SNRs und Algorithmen, wobei die entsprechenden höchsten SNR-Ergebnisse als Ground-Truth-Bilder verwendet werden, mit dem relativen SNR der Rekonstruktionsergebnisse unter verschiedenen SNRs und Algorithmen, um die Fähigkeit des Algorithmus zu demonstrieren, einen defokussierten Hintergrund zu unterdrücken. c: Modernste Rekonstruktionsergebnisse der Tubulinstruktur aus SIMnoise bei niedrigstem SNR mit entsprechendem Vergleich. d, Rekonstruktion für Aktinfilamente von OMX bei niedrigem SNR (5 %, 20 ms) mit entsprechendem Vergleich. e, Die mehrfarbige Rekonstruktion von Open-3DSIM des Kernporenkomplexes, Aktinfilament und Tubulin, angeregt bei 488, 561 bzw. 683 nm Wellenlänge. f, Open-3DSIM analysierte die 3D-Mitochondrienkammstruktur und zeigte den Prozess der mitochondrialen Fusion, Trennung und Apoptose bei einem niedrigen SNR (10 %, 3 ms) für 15 Bilder (10 s und sechs Scheiben pro Bild). g, Rekonstruktion und Polarisationsanalyse von Aktinfilamenten in Mäusenierenschnitten, einschließlich der gesamten 3D-Ansicht (oben) und der Projektion maximaler Intensität auf den xoy- und xoz-Ebenen, mit dem Vergleich zwischen pOMX, pSIMnoise und pOpen. Die Farbbalken in g haben das Format „Winkel (rad)“. Der Maßstabsbalken beträgt 2 μm. Skalen auf der z-Achse sind: a, 13 Schichten; c, 41 Schichten; d, zehn Schichten; e, 13 Schichten; f, sechs Schichten; und g, 41 Schichten. a, c, d, f, g 0,125 μm pro Schicht; e, 0,12 μm pro Schicht.

Darüber hinaus zeigen wir, dass Open-3DSIM mehrfarbige Proben in Abb. 2e mit dem N-SIM-System und Extended Data Abb. 9 sowie in der Ergänzenden Anmerkung 10 mit dem OMX-System genau rekonstruieren kann, was eine hervorragende optische Schnittfähigkeit und Kompatibilität mit verschiedenen Mikroskop-Workstations zeigt . Open-3DSIM wird auch zur Analyse der 3D-Mitochondrienkammstruktur in der Zeitrafferbildgebung eingesetzt. Wir beobachten eine klare Kammstruktur mit dem Prozess der mitochondrialen Fusion, Trennung und Apoptose bei niedrigem SNR, wie in Abb. 2f dargestellt. Zuletzt verwenden wir Open-3DSIM, um die Aktinfilamentstruktur in einer Mäuseniere mit der in Abb. 2g gezeigten Dipolorientierungsbildgebung zu rekonstruieren. Es ist ersichtlich, dass das polarisierte Open-3DSIM-Bild (pOpen) das polarisierte OMX-Bild (pOMX) und das polarisierte SIMnoise-Bild (pSIMnoise) bei der Artefaktunterdrückung und Defokussierungseliminierung in großem Maße übertrifft. Weitere Rekonstruktionen der fluoreszierenden Dipolorientierung werden in den erweiterten Daten gezeigt Abb. 10 (Ergänzende Anmerkung 11). Es ist bemerkenswert, dass mit der Intensitätskalibrierung die Dipolausrichtung von Open-3DSIM genauer aufgelöst wird als mit Standardannahmen. Um Benutzern die Verwendung von Open-3DSIM zu erleichtern, stellen wir in der Ergänzungstabelle 1 auch die Parameter der Rekonstruktion und in der Ergänzungstabelle 2 typische 3DSIM-Daten mit Ergebnissen, Parametern und Vergleichen bereit.

Mit hervorragender Leistung in Bezug auf hohe Wiedergabetreue, geringe Artefakte, Defokusentfernung und schwache Informationsspeicherung kann Open-3DSIM das Potenzial von 3DSIM in lateraler und axialer Superauflösung durch Mehrfarben-, Mehrschicht-, Zeitraffer- und Dipolorientierungsbildgebung wirklich freisetzen . Open-3DSIM ist plattformübergreifend, nicht auf bestimmte Mikroskop-Workstations beschränkt und kann je nach Benutzeranforderungen individuell angepasst und angepasst werden. Es ist außerdem erweiterbar, da es vollständig kompatibel mit anderen Algorithmenoptimierungsmethoden ist, die auf regulären Begriffen oder maschinellem Lernen basieren. Wir gehen davon aus, dass Open-3DSIM der Open-Source-Standard für die mehrdimensionale 3DSIM-Rekonstruktion sein wird und glauben, dass Open-Source-Bemühungen einen großen Unterschied für die Community machen werden.

Menschliche Osteosarkom-U2OS-Zelllinien (HTB-96, ATCC) wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, GIBCO) kultiviert, das 10 % hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (GIBCO) und 100 U ml–1 Penicillin und 100 µg ml–1 Streptomycin enthielt Lösung (PS, GIBCO) bei 37 °C in einem Inkubator mit 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2. Fixierte Zellen wurden auf Nr. plattiert. 1,5H-Deckgläser (CG15XH, Thorlabs), bevor sie auf eine geeignete Dichte gezüchtet (24 Stunden) und 15 Minuten lang mit 4 % Formaldehyd (R37814, Invitrogen) fixiert wurden. Anschließend wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen, um den Formaldehyd zu entfernen. Alexa Fluor 488 Phalloidin (A12379, Invitrogen) wurde verwendet, um die Aktinfilamente 1 Stunde lang bei Raumtemperatur zu färben. Anschließend wurde das Deckglas mit dem Prolong-Antifade-Eindeckmittel (P36941, Invitrogen) auf dem Objektträger versiegelt.

Die COS7-Zellen wurden in DMEM (GIBCO), das 10 % (V/V) fötales Rinderserum (GIBCO) und 100 U ml-1 Penicillin- und 100 µg ml-1 Streptomycin-Lösung (PS, GIBCO) enthielt, bei 37 °C in einem kultiviert Inkubator mit 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2. Die ausgewählten Zelllinien wurden auf Nr. ausgesät. 1,5H-Deckgläser (CG15XH, Thorlabs), bevor sie durch Inkubation in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % (V) CO2 bei 37 °C auf eine geeignete Dichte (24 Stunden) gezüchtet wurden. Die Zellen wurden in DMEM mit 500 nM MitoTracker Orange (M7510, ThermoFisher) und 0,5 % Dimethylsulfoxid 20 Minuten lang in einem CO2-Inkubator gefärbt. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und 15 Minuten bei Raumtemperatur in 4% Formaldehyd (R37814, Invitrogen) fixiert. Das Deckglas wurde auf dem Hohlraum des Objektträgers versiegelt. Das Deckglas wurde mit dem Prolong-Antifade-Eindeckmittel (P36941, Invitrogen) auf dem Objektträger versiegelt. Für die Bildgebung lebender COS7-Zellen wurden die COS7-Zellen auf µ-Slide 8 Wellhigh (80806, ibidi) ausgesät. Die COS7-Zellen wurden in DMEM mit 500 nM IMMBright660 und 0,5 % Dimethylsulfoxid 20 Minuten lang in einem CO2-Inkubator gefärbt. Anschließend wurden die Zellen ohne Waschen in DMEM für die Bildgebung lebender Zellen aufbewahrt.

Die zur Rekonstruktion der Aktinfilamente verwendeten Mäusenierenschnitte wurden von ThermoFisher erworben. Aktinfilamente wurden von Alexa Fluor 568 mit Prolong Diamond zum Einbetten markiert.

Die zur Rekonstruktion des Kernporenkomplexes verwendeten COS7-Zellen wurden von GATTA Quant erworben. Anti-Nup wurde von Alexa Fluor 555 mit Prolong Diamond zum Einbetten beschriftet.

Die zur Rekonstruktion der mehrfarbigen Probe verwendeten Rinderendothelzellen der großen Arterie wurden von ThermoFisher erworben. Mitochondrien wurden mit rot fluoreszierendem MitoTracker Red CMXRos markiert, F-Actin wurde mit grün fluoreszierendem Alexa Fluor 488 Phalloidin gefärbt und blau fluoreszierendes 4,6-Diamidino-2-phenylindol wurde verwendet, um die Kerne mit Prolong Diamond zum Einbetten zu markieren.

Wir erhalten Daten basierend auf dem kommerziellen OMX-SIM-System (DeltaVision OMX SR, GE) unter Verwendung eines Ölimmersionsobjektivs (Olympus, ×60 1,4 numerische Apertur (NA)) und einem kommerziellen N-SIM-System (Nikon) unter Verwendung eines Ölimmersionsobjektivs (CFI-Apochromat, ×100 1,49 NA).

Für das OMX-System wurden 3DSIM-Sequenzen mit einer Pixelgröße von 80 und 125 nm in der xoy- und xoz-Ebene durchgeführt (fünf Phasen, drei Winkel und 15 Rohbilder pro Ebene). Und für das N-SIM-System wurden 3DSIM-Sequenzen mit einer Pixelgröße von 65 und 120 nm in der xoy- und xoz-Ebene durchgeführt (fünf Phasen, drei Winkel und 15 Rohbilder pro Ebene).

Die Proben in Abb. 2c und in den erweiterten Daten Abb. 8a wurden aus Open-Source-Daten in SIMnoise (v.1.0)15,22 (https://data.4tu.nl/articles/_/12942932) erhalten. Die COS7-Zellen in Abb. 2e wurden von C. Leterrier (Universität Aix Marseille) unter Verwendung des Nikon-Systems erhalten. Beispiele in erweiterten Datenabbildungen. 2a, 3a und 4b wurden aus Open-Source-Daten in fairSIM (v.1.5.0)5 (http://www.fairsim.org/) erhalten. Die simulierte Struktur in Extended Data Abb. 5a wurde aus Open-Source-3D-Strukturdaten (v.1.2)23 (https://github.com/Biomedical-Imaging-Group/GlobalBioIm) erhalten. Das simulierte Auflösungstestbild in Extended Data Abb. 5b ist ISO12233:2000 (Imatest). Erweiterte Daten Abb. 6a wurde von AO-3DSIM (v.1.0.0)14 (https://www.ebi.ac.uk/biostudies/studies/S-BSST629) erhalten. Erweiterte Daten Abb. 6b wurde von 4BSIM (v.1.0)16 (https://zenodo.org/record/6727773) erhalten.

Open-3DSIM unterstützt drei Datenformate, darunter OMX (*.dv/*.tif/*.tiff), N-SIM (*.nd2/*.tif/*.tiff) und einige selbstgebaute Systeme (*.tif/ *.tiff). Die Bildsequenz für OMX ist Phase, Tiefe, Kanal, Zeit und dann Winkel. Die Bildsequenz für N-SIM ist Bild (Winkel in Zeilen und Phase in Spalten), Tiefe, Kanal und dann Zeit. Die Bildsequenz für selbstgebaute Systeme ist Phase, Winkel, Tiefe, Kanal und dann Zeit. Wir empfehlen, für die Rekonstruktion Proben aus sechs oder mehr Schichten zu verwenden, um optimale Ergebnisse zu erzielen.

Der Frequenzbereich und das SNR von Bildern wurden von ImageJ generiert. Zum Vergleich werden HiFi-SIM (v.1.01)7, SIMnoise (v.1.0)15, OMX, AO-SIM (v.1.0.0)14 und 4BSIM (v.1.0)16 herangezogen. Die Rekonstruktionen von Open-3DSIM wurden mit MATLAB (v.2018a, 2021a und 2021b) und ImageJ verarbeitet. Die Abbildungen wurden mit Imaris (v.9.0.1), Visio (v.2016), Origin (v.2021b) und Adobe Illustrator (v.2020) aufgezeichnet.

Fluoreszierende Perlen (ThermoFisher Scientific) mit einem Durchmesser von 200 nm wurden in einem festen Objektträger20 vorbereitet. Die Perlen wurden von OMX aus drei Winkeln mit fünf Phasen in jedem Winkel abgebildet. Durch die Mittelung der Bilder der fünf Phasen können Weitfeldbilder für jeden Winkel erhalten werden. Um die Lichtintensität an jedem Punkt zu korrigieren, sollten die Perlen auf der Brennebene dick sein. Anschließend wird die Lücke der Perlen durch Interpolation kompensiert, um eine Lichtintensitätskarte von Calibang1, Calibang2 und Calibang3 zu erstellen. Das Kalibrierungsverhältnis von Calib1 und Calib2 kann ausgedrückt werden als:

MAE und SNR in Abb. 2b werden zur Bewertung der Rekonstruktion von Open-3DSIM, SIMnoise und OMX-SIM verwendet. Nach der Bildkalibrierung zur Kompensation von Vibrationen während der Aufnahme werden die entsprechenden Ergebnisse mit hohem SNR unter verschiedenen Algorithmen als Grundwahrheit y(i) verwendet, sodass die Bilder mit niedrigem SNR y′(i) mithilfe von MAE berechnet werden:

Dabei bezeichnet i das i-te Pixel von ganzen m Pixeln und SNR wird verwendet, um die Fähigkeit verschiedener Algorithmen zu bewerten, den defokussierten Hintergrund zu entfernen. Wir wählen den Teil mit Signal und den Teil ohne Signal, um seinen Mittelwert und seine Varianz zu ermitteln, und verwenden die folgende Formel, um das SNR (dB) zu ermitteln:

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die ergänzenden Daten, Parameter, entsprechenden Vergleiche und das Installationsvideo der ImageJ-Version wurden auf Figshare hochgeladen (https://figshare.com/articles/dataset/Open_3DSIM_DATA/21731315)22,24.

Software, Testdaten und detaillierte Benutzerhandbücher für Open-3DSIM (MATLAB, ImageJ und Exe) wurden auf GitHub hochgeladen (https://github.com/Cao-ruijie/Open3DSIM). Wir beanspruchen eine Apache-Lizenz für Open-3DSIM.

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Referenzen herunterladen

PX dankt für die finanzielle Unterstützung durch das National Key R&D Program of China (Zuschuss-Nr. 2022YFC3401100) und die National Natural Science Foundation of China (Zuschuss-Nr. 62025501, 31971376 und 92150301). Wir danken dem National Center for Protein Sciences der Peking-Universität in Peking, China, für die Unterstützung bei der hochauflösenden Bildgebung von GE DeltaVision OMX. Wir danken C. Leterrier (Universität Aix Marseille) für die Bereitstellung von Daten aus dem Nikon N-SIM-System.

Abteilung für Biomedizintechnik, College of Future Technology, Peking-Universität, Peking, China

Ruijie Cao, Yaning Li, Xin Chen, Meiqi Li, Meiling Guan, Yiwei Hou, Yunzhe Fu, Xinzhu Xu und Peng Xi

National Biomedical Imaging Center, Peking-Universität, Peking, China

Ruijie Cao, Yaning Li, Xin Chen, Meiqi Li, Meiling Guan, Yiwei Hou, Yunzhe Fu, Xinzhu Xu und Peng Xi

Schlüssellabor für analytische Wissenschaft und Technologie der Provinz Hebei, Hochschule für Chemie und Umweltwissenschaften, Hebei-Universität, Baoding, China

Xichuan Ge & Baoxiang Gao

Institut für Biomedizintechnik, Beijing Institute of Collaborative Innovation, Peking, China

Shan Jiang

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RC und PX entwickelten die Idee von Open-3DSIM. PX überwachte die Forschung. RC, PX, YL, XC und MG leiteten die Theorie von Open-3DSIM ab. RC und ML haben die meisten Experimente entworfen und durchgeführt. ML, XG, BG, SJ und YF bereiteten die Probe vor. RC, PX, YL, XC, YH, ML, MG und XX diskutierten die Theorie von Open-3DSIM. RC und XC diskutierten die Optimierung der Parameterschätzung. RC und YL führten eine Optimierung des Datenspektrums durch. RC hat den Code von Open-3DSIM geschrieben. RC, YL, ML, YH und PX haben den Artikel mit Beiträgen aller Autoren verfasst.

Korrespondenz mit Peng Xi.

PX und RC sind Erfinder einer eingereichten Patentanmeldung im Zusammenhang mit dieser Arbeit (ZL202211605447.2). Die anderen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Methods dankt Hui Li, Marcel Muller und Lin Shao für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar. Hauptredakteurin für Handhabung: Rita Strack, in Zusammenarbeit mit dem Nature Methods-Team.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

An Farbbalken im Format „Intensität [au]“.

a, Wirkung der Spektrumoptimierung einschließlich der Rekonstruktion nach Notchfilter, nach Filter1 und nach Filter2, am Beispiel von Aktinfilamenten in lebersinusoidalen Endothelzellen (LSECs) von fairSIM. Die weißen Pfeile zeigen, dass nach zwei Filtern die Artefakte weniger werden und das weiße Profil zeigt, dass die Hochfrequenzinformationen erhalten bleiben. b, Die Rekonstruktionsergebnisse und Spektren (oben rechts eingebettet) zwischen verschiedenen Algorithmen, am Beispiel des Aktinfilaments in Abb. 2a. Maßstabsleiste: 2 μm (obere drei Linien und untere zwei Linien), 1 μm (mittlere zwei Linien). Maßstab auf der Z-Achse: a, 7 Schichten, b, 13 Schichten, 0,125 μm pro Schicht.

a, Das Diagramm von Filter1 und Filter2. b, Die Auswirkung verschiedener Parameter (w1 und w2) auf das Profil von Filter1 und Filter2 (weiße Linie in a). c, Das rekonstruierte Ergebnis des Aktinfilaments mit w1 = 0,5, w2 = 0,1. d, Die Wirkung verschiedener w2. e, Das Profil in d mit unterschiedlichem w2. f, Die Wirkung von w1. Maßstabsbalken: 2 μm. Maßstab auf der Z-Achse: 7 Schichten, 0,125 μm pro Schicht.

a, Kernporenkomplex, aufgenommen von OMX. b: Aktinfilament in U2OS-Osteosarkomzellen von fairSIM. Quantitative Auflösungskalibrierung von WF, HiFi-SIM und Open-3DSIM, einschließlich der Ergebnisse von c, Argolight und d, spärlich fluoreszierenden Perlen. Und das angepasste Profil auf der Z-Achse von e, Argolight und f, spärlich verteilten Fluoreszenzkügelchen, um die Halbhöhe, Vollgröße und Auflösung basierend auf 10 zufällig ausgewählten Punkten zu quantifizieren. Maßstabsbalken: 2 μm. Maßstab auf der Z-Achse: a, 17 Schichten, b, 8 Schichten, c, 33 Schichten, d, 8 Schichten, 0,125 μm pro Schicht.

a, Der Vergleich von Groud-Truth Image (GT), WF und Open-3DSIM und der Vergleich zwischen verschiedenen Z-Slices von Slice21 und Slice11 unter Verwendung einer Open-Source-3D-Struktur. b, Der Vergleich von GT, WF und Open-3DSIM anhand eines Auflösungstestbildes. Maßstabsbalken: 2 μm. Maßstab auf der Z-Achse: a, 33 Schichten (0,125 μm pro Schicht), b, 41 Schichten (0,125 μm pro Schicht).

a, Das Aktin der α-TN4-Linsenepithelzelle, deren Rekonstruktion von AO-3DSIM abgeleitet ist. b: Die Membran von sporulierendem B. subtilis, dessen Rekonstruktion von 4BSIM abgeleitet ist. Maßstabsbalken: 2 μm. Skalierung auf der Z-Achse: a, 26 Schichten, 0,2 μm pro Schicht, b, 32 Schichten, 0,125 μm pro Schicht.

einschließlich a, Kreuzstruktur und b, lineare Struktur (Das Intervall jeder Linie beträgt 0, 30, 60 bis 390 nm). Maßstabsbalken: 2 μm. Maßstab auf der Z-Achse: a, 26 Schichten, b, 33 Schichten, 0,125 μm pro Schicht.

a, Perlen mit der hochmodernen Rekonstruktion von SIMnoise1 bei niedrigem SNR. b: Mitochondriale Struktur bei niedrigem SNR. c, Kernporenkomplex unter hohem SNR. Maßstabsbalken: 2 μm. Maßstab auf der Z-Achse: a, 33 Schichten, b, 9 Schichten, c, 25 Schichten, 0,125 μm pro Schicht.

Rekonstruktion einer mehrfarbigen Probe des Zellkerns, des Aktinfilaments und des Mitochondriums, angeregt bei einer Wellenlänge von 405, 488 bzw. 568 nm. Und der Vergleich von WF und Open-3DSIM auf verschiedenen Z-Slices von Slice 6, 8 und 10. Maßstabsleiste: 2 μm. Maßstab auf der Z-Achse: 17 Schichten, 0,125 μm pro Schicht.

a, Vergleich zwischen Weitfeldbild, Open-3DSIM und pOpen. b, Intensitätskalibrierung verschiedener Beleuchtungswinkel. Das Intensitätsverhältnis zwischen Winkel2 und Winkel1 wird als „Calib1“ beschrieben, und das Intensitätsverhältnis zwischen Winkel3 und Winkel1 wird als „Calib2“ beschrieben. c, Rekonstruktion einer weiteren Aktinstruktur. Maßstabsbalken: 2 μm. Maßstab auf der Z-Achse: 9 Schichten, 0,125 μm pro Schicht. Bei Farbbalken im Format „Winkel [rad]“.

Ergänzende Abbildung 1, Anmerkungen 1–11 und Tabellen 1 und 2.

Dazu gehören drei Plattformen von Open-3DSIM.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Cao, R., Li, Y., Chen, X. et al. Open-3DSIM: eine Open-Source-Rekonstruktionsplattform für dreidimensionale strukturierte Beleuchtungsmikroskopie. Nat Methods 20, 1183–1186 (2023). https://doi.org/10.1038/s41592-023-01958-0

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Eingegangen: 01. Dezember 2022

Angenommen: 12. Juni 2023

Veröffentlicht: 20. Juli 2023

Ausgabedatum: August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41592-023-01958-0

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