Optische Kohärenz-Elastographie mit verzerrten Umgebungsschwingungen zur Profilierung der mechanischen Eigenschaften von Zellen, Organoiden und Gewebe

Aug 16, 2023

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 543 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Rolle der mechanischen Umgebung bei der Definition von Gewebefunktion, -entwicklung und -wachstum hat sich als grundlegend erwiesen. Die Beurteilung der Veränderungen der Steifigkeit von Gewebematrizen auf mehreren Skalen stützte sich meist auf invasive und oft spezielle Geräte wie AFM oder mechanische Testgeräte, die für den Zellkultur-Workflow schlecht geeignet sind. In diesem Artikel haben wir eine unvoreingenommene Methode der passiven optischen Kohärenz-Elastographie entwickelt Dabei werden Umgebungsvibrationen in der Probe ausgenutzt, was eine nichtinvasive quantitative Profilierung von Zellen und Geweben in Echtzeit ermöglicht. Wir demonstrieren eine robuste Methode, die optische Streuung und mechanische Eigenschaften entkoppelt, indem sie die mit der Streuung verbundene Rauschverzerrung aktiv ausgleicht und die Varianz verringert. Die Effizienz der Methode zur Ermittlung der Grundwahrheit wird in silico und in vitro validiert und für Schlüsselanwendungen wie die zeitliche mechanische Profilierung von Knochen- und Knorpelsphäroiden, Tissue Engineering-Krebsmodelle, Gewebereparaturmodelle und einzelne Zellen veranschaulicht. Unsere Methode lässt sich problemlos mit jedem kommerziellen optischen Kohärenztomographiesystem ohne Hardwaremodifikationen implementieren und bietet somit einen Durchbruch bei der gewebemechanischen Online-Bewertung räumlicher mechanischer Eigenschaften für Organoide, Weichgewebe und Tissue Engineering.

Es hat sich gezeigt, dass die mechanische Umgebung bei der Gewebehomöostase für die Funktion, Entwicklung und Pathologie mehrerer Organe von grundlegender Bedeutung ist1,2,3. Die Matrixsteifigkeit kann in vielen biologischen und medizinischen Anwendungen ein informativer Indikator sein. Beim Tissue Engineering sind die Masse und die räumlichen mechanischen Eigenschaften von künstlichen Transplantaten entscheidend für ihren klinischen Erfolg nach der Implantation4,5,6,7. Beispielsweise kann eine Nährstoffeinschränkung dazu führen, dass der zentrale Bereich im künstlichen Knorpel weicher wird8,9. In der Krebsforschung unterscheidet die Steifheit bösartiges Gewebe von gesundem Gewebe10, und die Überwachung der Veränderung der Steifheit des 3D-Krebszellmodells als Reaktion auf eine medikamentöse Behandlung gegen Krebs kann möglicherweise Aufschluss über die Wirksamkeit des Medikaments geben11. Im Auge ist die Steifheit der Hornhaut ein Hinweis auf ihre optische Leistung unter Augeninnendruck12. Herkömmliche Ansätze zum Testen der mechanischen Eigenschaften von manipulierten Geweben erfordern in der Regel direkten Kontakt mit dem Gewebe und sind unsteril, was den Abbruch der Zellkultur mit sich bringt13,14. Darüber hinaus liefert es nur Massenwerte und keinen lokalisierten Einblick in die räumliche mechanische Heterogenität des manipulierten Gewebes. Herstellungs- oder Langzeitkulturen benötigen eine einfache kontinuierliche Überwachung ohne Beschädigung der 3D-Kulturen, und optische Systeme bieten eine mögliche Lösung. Daher wird ein System zur sterilen Online-Überwachung der Masse und der räumlichen mechanischen Eigenschaften von In-vitro-3D-Geweben wie Zellmatrizen, Organoiden oder Ex-vivo-Explantaten benötigt.

Die Quantifizierung und räumliche Kartierung der Steifigkeit, ein als Elastographie bekannter Prozess, kann im Allgemeinen durchgeführt werden, indem eine Probe stimuliert, ihre Verformung gemessen und durch Anpassung an ein parametrisiertes Modell auf ihre mechanischen Eigenschaften geschlossen wird. Die Elastographie wurde zuerst mit Ultraschallbildgebung15, dann mit MRT16 und in jüngerer Zeit mit optischen Methoden implementiert, wie kürzlich besprochen wurde17. Die optische Kohärenztomographie (OCT)18 eignet sich aufgrund ihrer hochauflösenden, nicht-invasiven 3D-Bildgebungskapazität19 und ihrer Fähigkeit, Verschiebungen durch ihre Phase präzise zu kodieren20, besonders gut für die Elastographie-Verformungsverfolgung in kleinen Proben.

Frühe Methoden der optischen Kohärenzelastographie (OCE) verwendeten Oberflächenkompression mit Speckle-Tracking21,22 und später Phasenverzögerungsmessung23, aber das Konzept wurde mit vielen anderen Kontakt- und Nichtkontaktformen der Stimulation umgesetzt24. Ein erfolgreicher Ansatz besteht darin, durch punktuelle dynamische Belastung über einen Luftstoß kontrollierte Scherwellen in das Material einzuleiten25 und die ortsaufgelöste Wellengeschwindigkeit mithilfe der OCT zu messen, die eng mit der Steifigkeit des Materials verknüpft ist26 und in vivo27 nachgewiesen wurde. Natürlich vorkommende breitbandige diffuse Scherwellen können auch zur Messung der Scherwellenlänge28,29 genutzt werden, ein Konzept, das von Nguyen et al.30 mit OCT verwendet wird und dort als „passive Elastographie“ bezeichnet wird. Ein eng verwandter Ansatz von Zvietcovich et al.31 misst die Scherwellenlänge von Nachhallwellen einer Reihe von Kontaktpunktquellen, die mit einer einzigen Frequenz schwingen, und wurde dort erfolgreich ex-vitro zur Quantifizierung der Hornhautsteifheit angewendet.

Die passive Elastographie ist eine überzeugende Technik für den mechanischen Kontrast, da sie mit OCT-Systemen ohne zusätzliche Hardwaremodifikationen durchgeführt werden kann. Ohne dass ein Kontakt mit den Materialien erforderlich ist, kann die Analyse für Anwendungen im Tissue Engineering auf sterile Weise durchgeführt werden. Obwohl die Erfassung sowohl asynchron als auch langsam im Verhältnis zur Vibrationsquelle ist, was die Verwendung von Low-Frame-Sensoren ermöglicht, kann man dennoch die Scherwellenlänge aus einer Reihe von Verschiebungsfeldern mithilfe des Kreuzkorrelations-Bessel-Fit-Algorithmus aus Lit. abschätzen. 31 oder Verhältnis von Verschiebung zu Verformungsenergie von Ref. 30. Während Ersteres jedoch über die gesamte Anpassungsebene nur eine begrenzte räumliche Auflösung aufweist, ist Letzteres von Natur aus durch unterschiedliche Rauschpegel verzerrt. Daher schlagen wir eine Analyse vor, die als verzerrte Umgebungsschwingungen (OCE) bezeichnet wird, um eine räumlich variante verzerrte Schätzung der lokalen Wellenlänge zu erstellen, die für Materialien unterschiedlicher Größe und optischer Streueigenschaften geeignet ist.

Zuerst haben wir eine Scherwelle simuliert, die sich in einem zweiphasigen Material gemäß Gl. ausbreitet. (4) (Abb. 1a) mit einer Wellenlänge von λ1 = 2 mm im blauen Bereich und λ2 = 4 mm im gelben Bereich und testete die Leistung unseres Algorithmus zum Abrufen der Grundwahrheit mit einer langsamen und asynchronen Erfassung im Vergleich zur vibrierenden Quelle. Zeitraffer-Phasenmessungen (N = 195), die dem Verschiebungsfeld entsprechen, das durch die im Material wandernde Scherwelle (x-y-Ebene) induziert wird, werden in Abb. 1b mit einem additiven weißen Gaußschen Rauschen (Varianz σ = 0,05) simuliert werden als Eingaben für die OCE-Algorithmen verwendet, die die Wellenlänge entlang der x-Achse schätzen (Abb. 1c). Der passive OCE-Algorithmus, wie in Lit. dargestellt. 30 wird durch Rauschen in den Messungen verzerrt, was wir theoretisch zeigen. Dieser Effekt ist in Abb. 1c dargestellt und wird in Abb. 1d mit unterschiedlicher Geräuschpegelvarianz weiter untersucht. Da das Rauschen bei Verschiebungsschätzungen aus der OCT mit dem Signal-Rausch-Verhältnis32,33 zusammenhängt, hängt dieser passive Elastographiekontrast direkt mit den Streueigenschaften des Materials zusammen. Daher werden Materialien mit identischer Steifigkeit, aber unterschiedlicher optischer Streuung mit diesem Algorithmus fälschlicherweise differenziert. Um dieses Problem zu lindern, stellen wir einen Ansatz vor, der diese Rauschverzerrung aktiv kompensiert und die Varianz durch räumliche Filterung reduziert. Die Wirksamkeit davon wird in den Wellenlängenkarten in Abb. 1a und den Linienprofilen in Abb. 1c demonstriert. Die entzerrte Schätzung korrigiert den durchschnittlichen Fehler, führt jedoch eine große Varianz ein, die auf den Kompromiss zwischen Bias und Varianz zurückzuführen ist. Schließlich erzeugt unser vorgeschlagener verzerrter OCE-Algorithmus für Umgebungsvibrationen eine verzerrte Schätzung mit geringer Varianz, die der Grundwahrheit sehr nahe kommt. Am wichtigsten ist, dass die Trends für unterschiedliche Rauschpegel in Abb. 1d konsistent sind, was die Entkopplung von Streuintensität und mechanischem Kontrast ermöglicht.

a Zeigt die Grundwahrheit mit Wellen, die sich seitlich in einem zweiphasigen Material mit einer Wellenlänge von λ1 = 2 mm und λ2 = 4 mm ausbreiten, der verzerrten Schätzung aus der passiven Elastographie gemäß Gl. (6)29, die hochvarianzverzerrte Schätzung aus Gl. (8) und die vorgeschlagene entzerrte gefilterte Schätzung aus Gl. (9), das den mechanischen Kontrast bildet. Wellenlängen sind in der Abbildung gemäß Farbbalken farblich gekennzeichnet. b Zeigt die simulierte Zeitraffer-Phasenmessung, die durch das aus der Grundwahrheit berechnete Verschiebungsfeld unter Hinzufügung eines verrauschten Hintergrunds induziert wird. c Zeigt die Linienprofile durch die farbigen Bereiche in a. Panel d ist die geschätzte Wellenlängenabweichung für die passive Elastographie (alle roten Linien) und die verzerrte Umgebungsvibration OCE (blaue Linien) bei steigenden Geräuschpegeln.

Die zuverlässige Messung der elastischen Wellenlänge ermöglicht dann eine Schätzung der Steifigkeit. Für linear elastische isotrope Materialien ist beispielsweise E ∝ λ2, wobei E der Elastizitätsmodul und λ die durch unseren Algorithmus geschätzte Wellenlänge ist. Durch Kalibrierung und Messungen unter gleichen Bedingungen kann die Proportionalitätskonstante ermittelt werden. Weitere Details zum Zusammenhang zwischen Wellenlänge und Elastizitätsmoduln sind unten zusammengefasst.

Anschließend haben wir unseren Ansatz mit azellulären Agarosegelen unterschiedlicher Steifigkeit validiert, was in Abb. 2 zusammengefasst ist, wobei Implementierungs- und Verarbeitungsdetails sowie das Versuchsprotokoll vollständig unter „Methoden“ beschrieben sind. Nach der OCT-Bildgebung wurde der Young-Modul dieser Gele mithilfe eines Standardkompressionstests gemessen. Die OCT-Intensitätsbilder und berechneten mechanischen Kontrastkarten dieser Hydrogele sind in Abb. 2a dargestellt. Alle Gele hatten die gleiche Menge an optischem Kontrastmittel, aber unterschiedliche Konzentrationen an Agarose, was nachweislich mit der Steifigkeit korrelierte34, um optische Streuung und mechanische Eigenschaften zu entkoppeln. Mit zunehmender Konzentration aus den λ-Karten ist ein sichtbarer Anstieg der Steifigkeitsschätzung zu erkennen. Im Vergleich zum Young-Modul der Gruppen jeder Gelkonzentration (n = 3), wie in Abb. 2c dargestellt, besteht eine starke lineare Korrelation (r = 0,994), die das Modell E ∝ λ2 für dieses Material bestätigt. Im Folgenden bezeichnen wir die mittlere Wellenlänge im Quadrat, λ2, als „relative Steifigkeit“.

a Zeigt Beispiele für Intensität und mechanischen Kontrast. Alle Bilder sind 3×3 mm groß. Panel b ist ein Kantenlinienprofil und eine räumliche Auflösung, berechnet als FWHM der angepassten Sigmoid-Ableitung wie in Gl. (13); Die entsprechende räumliche Auflösung der axialen Kanten betrug 38,1 μm. c Mechanische Kalibrierung, durchgeführt als lineare Anpassung zwischen der quadratischen Wellenlänge und dem Elastizitätsmodul von Bose ElectroForce (n = 3), unter der Annahme des elastischen Modells in Gl. (3); Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. OCT-Intensitätsbilder werden als Logarithmus der mittleren Intensität angezeigt.

Die in Abb. 2a gezeigte Hybridagarose zeigt die Fähigkeit, heterogene Steifheit und lokale Variationen zu messen, ähnlich wie in Lit. 30. In diesem Fall erzeugt unser Algorithmus einen scharfen Kontrast zwischen den beiden Hälften des Gels und stimmt mit der Tiefe überein. Schließlich schätzten wir die räumliche Auflösung unserer Methode und unseres Systems anhand der Kantenübergänge mit dem entsprechenden Profil in Abb. 2b auf 47,4 μm lateral und 38,1 μm axial, vergleichbar mit der in Lit. angegebenen Auflösung. 31; Die Methode zur Berechnung der räumlichen Auflösung wird im Abschnitt „Methoden“ ausführlich beschrieben. Ohne Verzerrung kann die passive Elastographie auch einen ähnlichen mechanischen Kontrast liefern, wie in Lit. gezeigt. 30. Allerdings wird die quantitative Messung der Scherwellenlänge stark unterschätzt (siehe Abb. 1c und S2d), insbesondere bei Vorhandensein von Rauschen (Abb. 1d). Im Gegensatz dazu liefern OCE mit entzerrter Umgebungsvibration einen genauen Wert für die Wellenlänge in der Simulation (Abb. 1c), selbst bei Vorhandensein von Rauschen (Abb. 1d), und einen realistischen Wert für die Wellenlänge für reale Proben, der gut mit mechanischen Messungen korreliert (siehe Abb. 2c).

Die Analyse der Matrixsteifigkeit beim orthopädischen Tissue Engineering ist für die Beurteilung und potenzielle Ergebnismessung bei der Herstellung medizinischer Implantate von entscheidender Bedeutung. Als Anwendung der entzerrten Umgebungsvibrations-OCE-Analyse im Knochengewebe-Engineering haben wir mesenchymale Stammzellpellets (MSC) in osteogener Differenzierung 21 Tage lang kultiviert und dabei kontinuierlich ihre Steifigkeit mit entzerrter Umgebungsvibrations-OCE auf sterile Online-Weise gemessen. Die Validierung wurde an einer Teilmenge der Probe mit abschließenden mechanischen Tests durchgeführt. Die in Abb. 3b gezeigten mechanischen Tests zeigen, dass der Elastizitätsmodul der künstlich hergestellten Knochengewebe während der gesamten Kultur deutlich zunimmt. Dieser Anstieg des mechanischen Kontrasts ist auch in den λ-Karten in Abb. 3a in jedem der Pellets im Laufe der Zeit deutlich zu erkennen. Anschließend wurde die relative Steifigkeit aufgrund der entzerrten Umgebungsvibration OCE für jedes der Pellets quantifiziert und in Abb. 3c dargestellt. Sie zeigt einen monotonen Anstieg über die Kultur für jede Probe, im Einklang mit den mechanischen Testdaten. Mit zunehmender Kulturdauer wurde eine verstärkte Kollagenfärbung in osteogenen Pellets beobachtet, was auf einen Anstieg des Matrixgehalts während der Kultur hindeutet und die mechanischen Testdaten und die OCT-Analyse weiter stützt. Räumliche Heterogenitäten wurden sowohl in mechanischen Kontrastkarten als auch in der Histologie beobachtet.

Panel a zeigt Beispiele der Intensität und des mechanischen Kontrasts von künstlichem Knochengewebe (in dreifacher Ausfertigung) an den Tagen 3, 10 und 21. Alle präsentierten Bilder sind 1×1 mm groß. b Zeigt den Elastizitätsmodul des Gewebes, getestet mit einem maßgeschneiderten Kompressionsgerät (n = 4)40. Panel c ist die relative Steifheit für jede Probe während der gesamten Kultur (n = 3). d Histologie mit Picrosirius-Rot-Färbung für den Kollagengehalt in osteogenen Pellets an den Tagen 3, 10 und 21. Orange Färbung zeigt Zytoplasma an und rote Färbung weist auf neu synthetisierte Kollagenfibrillen hin; Maßstabsbalken: 100 μm. e Zeigt Intensität und mechanischen Kontrast von künstlich hergestelltem Knorpelgewebe, das 21 Tage lang durch hydrostatischen Druck stimuliert wurde. Feld f ist der Glykosaminoglykan-Gehalt (GAG) der Proben (n = 4) und g zeigt die relative Steifigkeit aus der OCE-Analyse mit verzerrter Umgebungsschwingung (n = 3). * bezeichnet einen signifikanten Unterschied mit ap < 0,05 und ** mit p < 0,01, berechnet mit dem 1-Wege-Anova-Test gefolgt von einem Tukey-Kramer-Vergleich der Mittelwerte. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar.

Anschließend wandten wir eine entzerrte Umgebungsvibrations-OCE-Analyse auf MSC-Zellpellets an, die 21 Tage lang in einem chondrogenen Medium kultiviert wurden. N=3 Proben wurden einem hydrostatischen Druck ausgesetzt, um die Differenzierung weiter zu verbessern, während der Rest (N=3) als Kontrolle aufbewahrt wurde. Wie erwartet zeigte die biochemische Analyse einen Anstieg des Glykosaminoglykangehalts (GAG) in der stimulierten Gruppe, wie in Abb. 3f dargestellt, was auf eine Zunahme der Steifheit schließen lässt. Dies spiegelt sich sowohl in den λ-Karten in Abb. 3e als auch in der zusammengefassten quantitativen Analyse gut wider in Abb. 3g.

Wir haben das Potenzial von OCE mit entzerrter Umgebungsvibration in der Krebsforschung zur Überwachung der räumlichen mechanischen Eigenschaften eines durch Gewebezüchtung hergestellten Krebsmodells untersucht. Wir haben zunächst 11 Tage lang mit Fibroblasten besiedelte Kollagengele kultiviert. Wie erwartet zeigte unsere Analyse einen stetigen Anstieg der relativen Steifheit des mit Fibroblasten besiedelten Kollagengels nach der Kulturzeit Abb. 4a, b. Dann wurden Eierstockkrebszellen sieben Tage lang auf das Kollagengel ausgesät und konnten durch Analyse des mechanischen Kontrasts zwischen den beiden leicht von der Kollagengelschicht unterschieden werden (Abb. 4c, d). Dies wurde durch die Histologie gestützt (Abb. 4e, f).

a Zeigt die Intensität und den mechanischen Kontrast von mit Fibroblasten besiedelten Kollagengelen über eine 11-tägige Kultur. Alle dargestellten Bilder sind 6×3 mm groß. b Zeigt ihre entsprechende Steifigkeit im Zeitverlauf. c Zeigt die Intensität und den mechanischen Kontrast von Kollagengelen mit und ohne darauf kultivierte Krebszellen für 7 Tage. d Mechanische Eigenschaften gemessen entlang der roten Linie in c. e, f Histologiebilder für c, gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin. Maßstabsleiste: 1 mm.

OCT ist ein Routineinstrument für die Augenheilkunde und unsere Methode könnte diese Kapazitäten auf die routinemäßige Überwachung von Oberflächenrekonstruktionen erweitern. Daher untersuchten wir das Potenzial der OCE mit entzerrter Umgebungsvibration, um die Qualität und Effizienz eines Gelsystems zur Reparatur kleiner Hornhautläsionen zu bewerten. Schweinehornhäute (N = 3) wurden biopsiert, um eine lokale Wunde zu erzeugen. Anschließend wurde eine Lösung aus 15 % oder 20 % methacrylierter Seidenfibroinlösung in die Verletzungsstelle injiziert, UV-vernetzt und mit OCT abgebildet (Abb. 5a). Die OCE-Analyse mit verzerrten Umgebungsvibrationen zeigte eine deutlich höhere relative Steifigkeit in der 20 %-Gel-Gruppe, was mit den mechanischen Daten übereinstimmt, die durch Rheologietests erhalten wurden (Abb. 5b, c). Während OCT-Intensitätsbilder in keiner der Gruppen offensichtliche Hohlräume an der Grenzfläche zwischen Gel und Hornhaut zeigten, wurden für beide Gruppen klare Hohlräume in der Karte des mechanischen Kontrasts (λ) identifiziert (siehe weiße Pfeile), was auf das Vorhandensein einer ungehärteten Gellösung hinweist . Dies deutet darauf hin, dass die OCE mit entzerrter Umgebungsvibration ein leistungsstarkes Instrument zur Beurteilung der Qualität und Effizienz der Gewebereparatur sein kann.

a Zeigt die Intensität und den mechanischen Kontrast von Schweinehornhäuten intakt und nach der Implantation von zwei unterschiedlichen Hydrogelkonzentrationen; Die weißen Pfeile zeigen Bereiche mit ungehärtetem Gel an, die einen hohen mechanischen Kontrast, jedoch keine Intensität aufweisen. b Zeigt den Speichermodul aus der Rheologie von Hydrogelproben (n = 3). c Zeigt die relative Steifheit aus OCT-Scans (n ​​= 3). d Zeigt eine Studie über die mechanischen Eigenschaften von Maus-Oozyten: Vergleich von zona-intakten und zona-freien Wildtyp-Oozyten und intakten Histon-H3.3-Knockout-Oozyten; Die Zona-intakten Wildtyp-Oozyten weisen eine größere Steifigkeitsheterogenität auf, die sich deutlich von der Zona-freien und weniger entwicklungskompetenten Zona-intakten H3.3-Knockout unterscheidet. Die Bilder der Eizellen wurden auf 100 × 300 Mikrometer (x–z) zugeschnitten. * bezeichnet einen signifikanten Unterschied mit ap < 0,05 und ** mit p < 0,01, berechnet mit dem 1-Wege-Anova-Test gefolgt von einem Tukey-Kramer-Vergleich der Mittelwerte. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar.

Routinemäßige Fertilitätsstudien können die Beurteilung der Lebensfähigkeit und Entwicklungskompetenz vorbefruchteter Eizellen umfassen. Jüngste Studien legen nahe, dass die Steifheit der Eizelle mit ihrer Lebensfähigkeit und dem Entwicklungspotenzial des Embryos zusammenhängt35. Die Anwendung der entzerrten Umgebungsvibrations-OCE-Analyse auf Eizellen von Mäusen ist in Abb. 5d zusammengefasst. Wir verglichen intakte und von Zona pellucida befreite Eizellen von Wildtyp-Mäusen mit Cabin1-Knockout, das nachweislich zum Stillstand der embryonalen Entwicklung führt36. Erstens wurde ein signifikanter Unterschied in der mittleren Wellenlänge gegenüber der Kontrollgruppe beobachtet, was wie in den Referenzen ein Mittel zur Beurteilung ihrer Lebensfähigkeit sein könnte. 35,37. Die mechanische Kontrastkarte zeigte einen steiferen Außenring bei Wildtyp-Zona-intakten Mäusen im Vergleich zu zonenfreien und zona-intakten Cabin1-Knockout-Mäusen (Abb. 5d). Dies deutet darauf hin, dass die entzerrte Umgebungsvibrations-OCE im Gegensatz zur Mikropipettenaspiration ein wirksames Instrument für das berührungslose Screening entwicklungsfähiger Eizellen auf nichtinvasive Weise sein kann34.

Die entzerrte Umgebungsvibrationsanalyse ist ein Nachverarbeitungsalgorithmus zur Ableitung quantitativer mechanischer Kontrastkarten aus OCT-Scans, der die Streuung und die mechanischen Eigenschaften entkoppelt. Der Ansatz basiert auf der Wellenlängenschätzung von elastischen Umgebungswellen, die von mehreren Quellen unter Laborbedingungen erzeugt werden. In optischen Forschungslaboren ist es meist erforderlich, Experimente in einer vibrationsfreien Umgebung durchzuführen. Eine Vielzahl naher und entfernter Vibrationsquellen wie Heizung, Lüftung, Klimaanlage, Inkubatoren, Pumpen, Computer, wissenschaftliche Geräte, Straßen- und Schienentransportsysteme summieren sich jedoch zu einem unvermeidbaren Vibrationshintergrundgeräusch, das an die Umgebung gekoppelt ist. Zu diesem Zweck werden optische Systeme auf speziellen passiven oder aktiven Vibrationstischen aufgebaut. In unserer Studie betreiben wir unser OCT-System jedoch bewusst auf einer Bank, um die Umgebungsvibrationen optimal nutzen zu können.

Darüber hinaus haben wir eine FEM-Analyse durchgeführt, um zu zeigen, dass externe Vibrationen, die auf eine Well-Platte ausgeübt werden, tatsächlich ausreichend Wellen in der Probe erzeugen. Es ist auch erwähnenswert, dass wir in unserem Versuchsaufbau Maßnahmen ergreifen müssen, um das Ausmaß der Umgebungsvibrationen zu reduzieren, indem wir die Platte in eine Kammer mit Gummiboden legen, um Phasenumwicklungen und Artefakte durch große Verschiebungen zu vermeiden.

Umgebungsvibrationen sind auch für In-vivo-Studien relevant, da natürlich entstehende Scherwellen aus der Aktivität des menschlichen Körpers verwendet wurden, um die elastischen Eigenschaften von Geweben qualitativ zu bewerten28,38.

Darüber hinaus wurde das Potenzial einer passiven optischen Kohärenz-Elastographie in vivo auch für die Hornhaut eines anästhesierten Rattenauges nachgewiesen30.

Die räumliche Auflösung ist ein wichtiger Aspekt bei jeder Bildgebungsmethode, und die Fähigkeit, unterschiedliche Materialsteifigkeiten aufzulösen, ist ein Hauptvorteil von OCE. Theoretisch ist unsere Methode nur durch die Anzahl der Pixel, über die die Dehnungsleistung berechnet wird, oder den Filterkern begrenzt. Für die Agarosestudie in Abb. 2 berechnen wir die seitliche Belastung mit einem Schiebefenster von 7 Pixeln und verwenden einen Gauß-Filter mit einer räumlichen Standardabweichung von 5 Pixeln, was zu einem FWHM von 11,8 Pixeln und einer erwarteten räumlichen Auflösung von lateral 41,3 μm und 20,9 μm führt μm axial, was mit den 47,4 μm und 38,1 μm vergleichbar ist, die wir empirisch vom Kantenübergang aus gemessen haben. Bei Vorhandensein von Rauschen gibt es einen Kompromiss zwischen Bias, räumlicher Auflösung und Varianz, der durch die Parameter Ng und Nh gesteuert werden kann. Je höher das Rauschen, desto geringer ist die erreichbare räumliche Auflösung bei gegebener Genauigkeit. Daher ist der Grad der optischen Streuung wichtig für ein hohes SNR, ohne das Signal zu dämpfen und die Durchdringung zu verringern. Schließlich bezeichnen wir die mittlere Wellenlänge als relative Steifigkeit und vernachlässigen dabei die Viskoelastizität. Dies wurde durch die Tatsache motiviert, dass das elastische Verhalten in weichem, inkompressiblem Gewebe durch den Schermodul dominiert wird, der linear mit dem Quadrat der Scherwellenwellenlänge variiert, wie es üblicherweise in der passiven Elastographie verwendet wird30. Unsere experimentellen Daten (Abb. 2c), die eine starke lineare Abhängigkeit (r = 0,994) zwischen dem gemessenen Young-Modul und dem Quadrat der Scherwellenwellenlänge zeigen, bestätigten, dass viskoelastisches Verhalten in dieser Näherung vernachlässigt werden konnte. In unserer Studie haben wir den Ansatz anhand gängiger Beispiele validiert, bei denen die Steifheit eine Kernbewertung während der Kultur- oder Ergebnisbewertung ist. Unsere Ergebnisse haben gezeigt, wie wir orthopädische Gewebe wie Knorpel und Knochen während der Differenzierung in intakten Geweben, durch Gewebezüchtung hergestellte Krebsmodelle, die Fruchtbarkeitsbewertung von Eizellen in vitro und ophthalmologische Anwendungen beurteilen können, bei denen die Steifheit von Biomaterialien im Zeitverlauf nach der Implantation beurteilt werden kann.

OCE mit entzerrten Umgebungsschwingungen ist ein leistungsstarkes Werkzeug zur räumlichen Bewertung von Biomaterialien und Biomatrizen in vitro in 3D-Kulturen, da es ein quantitatives mechanisches Kontrastbild oder eine λ-Karte erzeugt, das vom Standardbild der Streuintensität aus der OCT und diesen zusätzlichen Informationen entkoppelt ist kann verwendet werden, um wichtige Veränderungen in der Probe anzuzeigen. Darüber hinaus kann man die „relative Steifheit“ einer Region als mittlere quadratische Wellenlänge extrahieren, die direkt proportional zum Young-Modul eines isotropen linear elastischen Materials ist, wie in Agaroseproben validiert. Anhand biologischer Systeme mit unterschiedlichen Matrixeigenschaften zeigen wir, dass dieser effektive und „einfach zu verwendende“ Ansatz einen Durchbruch bei der gewebemechanischen Online-Bewertung räumlicher mechanischer Eigenschaften für Organoide, Weichgewebe und Tissue Engineering bietet.

Das für die Agarose- und hMSC-Pellet-Studie verwendete System war ein Spektraldomänen-OCT-System Thorlabs Telesto-II mit einer Wellenlänge der zentralen Quelle von 1310 nm, das mit einer Scanlinse (LSM03 Thorlabs) ausgestattet war, was zu einer axialen Auflösung von 4,1 μm im Gewebe und einer lateralen Auflösung von führte 15 Mikrometer. Die Aufnahme bestand aus 192 Bildern mit jeweils 1000 A-Scans bei einer Rate von 48 kHz. Im Fall der mit Eizellen und Krebs besiedelten Kollagengele war das System ein 800-nm-System von Wasatch Photonics mit einer spektralen Bandbreite von 92 nm, wobei die Messungen aus 100 Bildern von 512 A-Scans mit einer Rate von 30 kHz bestanden. In allen Fällen wurden die Proben in Standard-Gewebekultur-Wellplatten auf derselben Bank wie die OCT-Sonde platziert, um die Übertragung von Vibrationen zu ermöglichen.

Die Vorverarbeitung wurde mit maßgeschneiderter Software durchgeführt, um das Spektrometer erneut in den k-Raum abzutasten, das Hintergrundsignal zu entfernen und die schnelle Fourier-Transformation zur Abbildung in den komplexwertigen Verzögerungsraum durchzuführen. Die Verschiebungsfelder zwischen aufeinanderfolgenden Frames wurden dann mit geschätzt

Dabei ist λ0 die zentrale Wellenlänge der Quelle, neff der effektive Brechungsindex der Probe, ℜ und ℑ nehmen den Real- und Imaginärteil an und pt+1 ist die nachfolgende komplexe Messung von pt. Aus diesen Verschiebungsfeldern werden dann die elastischen Wellenlängen durch () geschätzt.

Wir möchten die ortsaufgelöste Steifigkeit eines Materials anhand seiner Wellengeschwindigkeit abschätzen

wobei ρ seine Massendichte und M ein Elastizitätsmodulfaktor ist. Diese generische Form gilt für: Scherwellen, wobei \(M=\frac{1}{3}\mu\), wobei μ der Schermodul ist; P-Wellen, wobei \(M=K+\frac{4}{3}\mu\), wobei K der Kompressionsmodul ist; und Rayleigh-Oberflächenwellen, wobei \(M=\frac{{(0,862+1,14\nu )}^{2}}{2{(1+\nu )}^{2}}\mu\) mit ν der Poisson-Kurve Verhältnis. Wie bei jeder Wanderwelle kann die Geschwindigkeit als v = λf ausgedrückt werden, wobei λ ihre räumliche Wellenlänge und f ihre zeitliche Frequenz ist. Wenn f und ρ entweder bekannt sind oder a priori festgelegt sind, kann man den Elastizitätsmodul M direkt aus dem gemessenen λ berechnen.

Unter der Annahme von Scherwellen, wie in Lit. 29,31 und einem linear elastischen isotropen Material kann der Elastizitätsmodul als ermittelt werden

Wenn sich periodische elastische Wellen durch ein heterogenes Material ausbreiten, kann man deren Verschiebung an einer Position x as messen

Dabei ist a die Amplitude der Welle, λ die räumliche Wellenlänge und ϕ(t) eine Phasenfunktion, die die Position der Welle zum Zeitpunkt t beschreibt. Man kann die lokale Dehnung auch als Finite-Differenzen-Näherung an eine Ableitung schätzen als

wobei Δx die Auflösung des Bildgebungssystems ist. Da die Energie einer ausreichend abgetasteten Sinuskurve unabhängig von der Reihenfolge der Abtastungen Nta2/2 beträgt, folgt daraus, dass λ durch ermittelt werden kann

wobei \(\mathop{\sum }\nolimits_{t = 1}^{{N}_{t}}d{(t)}^{2}\) die Verschiebungsenergie aus einer Folge von Wellenmessungen wie dargestellt ist in Gl. (4). Die Schätzung in Gl. (6) entspricht dem in Ref. dargestellten. 29 und in Lit. verwendet. 30. Die Schätzung in Gl. (6) ist in einem rauschfreien System exakt, da Δx → 0 und die Anzahl der zeitlichen Abtastwerte Nt → ∞. In diesem Fall kann ϕ(t) die Form ϕ(t) = kt annehmen, wobei k ein Skalar oder eine Zufallsfunktion ist, die [ − π, π] mit gleichmäßiger Wahrscheinlichkeitsdichte aufspannt. Wenn man beispielsweise eine lineare Abtastung mit Zeitjitter wie ϕ(t) = kt + n mit \(n \sim {{{{{{{\mathcal{N}}}}}}}}(0,{ \sigma }_{t}^{2})\), dann Gl. (6) ist für ausreichend viele Messungen immer noch genau.

Obwohl die Wellenlängenschätzung in Gl. (6) im rauschfreien Fall gilt, wird es in der Praxis stark durch jegliches Phasenrauschen verzerrt. Dies liegt daran, dass die Scherwellenlänge im Millimeterbereich liegt29,31, was weitaus größer ist als die räumliche Abtastauflösung in der OCT, sodass jegliches additive Breitbandrauschen durch den Gradienten in Gleichung (1) verstärkt wird. (5).

Für additives weißes Gaußsches Rauschen (AWGN) gilt \(n \sim {{{{{{\mathcal{N}}}}}}}}(0,{\sigma }^{2})\), mit Varianz σ2 ist die Signalenergie nach der Filterung mit einem Kernel h

wobei Nh die Länge von h ist. Beispielsweise ist die zentrale Differenzgradientennäherung in Gl. (5) entspricht der räumlichen Filterung des Verschiebungsvektors mit Kern h = [ − 0,5, 0, 0,5]/Δx, der eine Energie von En = 0,5σ2/Δx2 hat. Wenn σ aus den Proben geschätzt werden kann, kann man die verzerrte Schätzung der Wellenlänge als bilden

wobei * räumliche Faltung bezeichnet.

Während Gl. (8) kann bei mäßig geringem Rauschen sinnvoll sein. Wenn die Rauschenergie den Signalenergien ähnlich ist, führt dies zu einer hohen Varianz oder sogar zu undefinierten Schätzungen. Dies kann bis zu einem gewissen Grad durch Erhöhen von Ng oder Nt kompensiert werden, allerdings auf Kosten der zeitlichen Reaktionsrate und der Scanzeit oder der räumlichen Auflösung in der Gradientenrichtung und führt nicht dazu, dass der Zähler negativ wird. Wir führen daher einen zusätzlichen 2D-Tiefpassfilter für die Verschiebungsvektoren ein. Diese entzerrte gefilterte Schätzung als

Dabei ist g der 2D-Tiefpassfilter und Nh*g = Nh + Ng − 1 die Länge des effektiven Dehnungsfilterkerns. Wir verwenden eine 2D-Gaußsche Funktion für g, da sie keine Welligkeitsartefakte mit der Größe Ng = ⌈2cg⌉ + 1 einführt, wobei cg die räumliche Standardabweichung der Gaußschen Funktion ist. Der Gauß-Filter erzeugte ein Speckle-Muster auf den mechanischen Kontrastkarten.

Trotz der Filterung und effektiven Rauschleistungsreduzierung in Gl. (9) kann es aufgrund möglicher Negativität immer noch Fälle undefinierter Schätzungen geben. Um dies zu vermeiden, verwenden wir einen „sanften Subtraktions“-Ansatz, wie er bei der Streukorrektur der Röntgen-Computertomographie verwendet wird39

Dies ersetzt die Operation a − b, wobei γ ein Kompensationsfaktor ist, der wie folgt berechnet werden kann

wobei β = [0, 1] ein Schwellenwertterm ist, den wir in dieser Arbeit auf β = 0,9 setzen. In unseren Experimenten beginnt dies erst sehr tief in den Proben zu wirken, wo die Intensität ohnehin zu gering für eine zuverlässige Messung ist.

Eine letzte Überlegung für diese Methode ist die Bestimmung der Rauschvarianz σ2. Unter der Annahme, dass dies räumlich variiert und die Wellenlänge deutlich größer als die räumliche Auflösung des OCT-Systems ist, kann sie als zeitlich gemittelte Varianz innerhalb eines gleitenden 3 × 3-Fensters angenähert werden.

Insgesamt wurden in dieser Studie 1 %, 2 % und 3 % Agarose-Hydrogele mit 1 % Milch hergestellt. Kurz gesagt wurde Agarose vom Typ I (Fisher Scientific, UK) zu destilliertem Wasser gegeben und bei 121 °C autoklaviert, um 2 %, 4 % und 6 % Agaroselösungen herzustellen. Eine 2 %ige Milchlösung wurde durch Auflösen von fettfreiem Trockenmilchpulver (Bio-rad, UK) in destilliertem Wasser hergestellt und diese Lösung mit gleichen Volumina einer 2 %, 4 % und 6 %igen Agaroselösung bei 100 °C gemischt und in eine Schale gegossen und bei Raumtemperatur erstarren gelassen, um 1 %, 2 % und 3 % Agarosegele mit 1 % Milch herzustellen. 2/3 %-Hybridgele wurden hergestellt, indem ein Teil des 2 %-Gels abgekratzt und 3 %-Agaroselösung in die Schale gegeben und erstarren gelassen wurde. Anschließend wurden die Gele mit einer Biopsiestanze entkernt, um Scheiben mit einem Durchmesser von 6 mm und einer Dicke von 2 mm herzustellen. Diese Gele wurden dann in eine Gewebekulturplatte mit 96 Vertiefungen gegeben, wobei 100 μl destilliertes Wasser die Oberfläche jedes Gels bedeckten, und mit OCT zur Wellenlängenmessung abgebildet, wie zuvor beschrieben.

Der Elastizitätsmodul dieser Agarosegele wurde mit Bose ElectroForce 5500 (TA Instruments, UK) getestet. Kurz gesagt, überschüssiges Wasser wurde aus Agarosegelen entfernt und eine Vorlast von 0,01 N wurde verwendet, um den direkten Kontakt zwischen Proben- und Plattenoberflächen sicherzustellen. Es wurde eine uneingeschränkte Rampenkompression (bis zu 10 % Dehnung der Probendicke) durchgeführt und der Elastizitätsmodul aus der Spannungs-Dehnungs-Kurve berechnet.

Die Hinterbeine von Schafen wurden von einem örtlichen Schlachthof gekauft und mesenchymale Stammzellen (MSCs) von Schafen wurden aus dem Knochenmark des Femurs isoliert. Daher war für diese Studie keine ethische Genehmigung erforderlich. MSCs aus Passage zwei wurden trypsiniert und 200.000 Zellen in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit V-Boden (Greiner Bio-One) gegeben und 5 Minuten lang bei 500 × g zentrifugiert, um Zellpellets zu bilden.

Zur chondrogenen Differenzierung wurden Zellpellets in einem Differenzierungsmedium kultiviert, das aus DMEM mit hohem Glucosegehalt, ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin-0,1 mg/ml Streptomycin, 100 μg/ml Natriumpyruvat, 40 μg/ml L- Prolin, 50 μg/ml L-Ascorbinsäure-2-phosphat, 4,7 μg/ml Linolsäure, 1,5 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA), 1 × Insulin-Transferrin-Selen, 100 nM Dexamethason (alle von Sigma-Aldrich, UK) und 10 ng/ml rekombinanter humaner TGF-β3 (Peprotech, UK) für 3 Wochen, wobei das Medium dreimal pro Woche ausgetauscht wird. Während dieser Differenzierungsperiode wurde die Hälfte der Pellets einem hydrostatischen Druck (HP, 270 kPa, 1 Hz, 1 Stunde/Tag) ausgesetzt, um die Differenzierung zu verbessern, während der Rest nicht stimuliert und als Kontrolle aufbewahrt wurde. Sowohl die Kontroll- als auch die HP-Gruppe wurden am Ende des Differenzierungszeitraums geerntet und mit OCT zur Wellenlängenmessung abgebildet. Anschließend wurden die Proben mit Papain verdaut, um ihren Glykosaminoglykan (GAG)-Gehalt mithilfe eines Dimethylmethylenblau-Farbstoffbindungstests zu messen. Außerdem wurden Proben für die Histologie entnommen, in Wachs eingebettet, geschnitten und mit 1 % Alcianblau 8GX in 0,1 M HCl zur GAG-Verteilung gefärbt.

Zur osteogenen Differenzierung wurden Zellpellets in einem Differenzierungsmedium kultiviert, das aus DMEM mit niedrigem Glucosegehalt, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin – 0,1 mg/ml Streptomycin, 100 nM Dexamethason, 50 μM L -Ascorbinsäure-2-phosphat und 10 mM β-Glycercophosphat (alle Sigma-Aldrich, UK) für 3 Wochen, wobei das Medium dreimal pro Woche ausgetauscht wurde. Während dieses Differenzierungszeitraums wurden die Proben kontinuierlich mittels OCT auf sterile Weise zur Wellenlängenmessung an den Tagen 3, 10 und 21 überwacht, wobei separate Proben in Parallelkultur zu denselben Zeitpunkten für mechanische Tests und Histologie beendet wurden. Der Elastizitätsmodul osteogener Zellpellets wurde mit einem speziell für die Prüfung von Mikrosphären und Zellorganoiden konzipierten Gerät getestet40. Nachdem überschüssiges Wasser entfernt worden war, wurden Zellpellets zwischen zwei Plattenoberflächen plattiert und eine uneingeschränkte Rampenkompression (bis zu 25 % Dehnung des Probendurchmessers) durchgeführt und der Young-Modul aus der Spannungs-Dehnungs-Kurve berechnet. Zur histologischen Analyse wurden Zellpellets in Wachs eingebettet, geschnitten und zur Kollagenanreicherung mit Picrosirius-Rot gefärbt.

Kollagen/Fibroblasten-Matrizen wurden unter Verwendung der von Timpson et al.41 beschriebenen Methodik erstellt. Die Matrizen wurden 15 Tage lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert, damit sich die Kollagen-/Fibroblastenmatrix zusammenziehen konnte. Die Kollagen/Fibroblasten-Matrix wurde mittels OCT an den Tagen 1, 4, 7, 11 und 15 der Probenkontraktion abgebildet.

Unter Verwendung des in Hallas-Potts et al.42 beschriebenen Protokolls wurden eine Kollagen/Fibroblasten-Matrix mit A2780-Kultivierung darauf und eine leere Kollagen/Fibroblasten-Matrix ohne darauf kultivierte Zellen vorbereitet und auf ein Metallgitter übertragen. Das Verschieben der Kollagenmatrix auf das Gitter wird auf Tag 0 bezogen. Die Schalen wurden 7 Tage lang bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert, um den Zellen das Eindringen zu ermöglichen. Die Kollagen/Fibroblasten-Matrizen wurden an den Tagen 2 und 7 abgebildet.

Unmittelbar nach der OCT-Bildgebung wurde die Matrix vom Gitter entfernt und in ein Falcon-Röhrchen mit 5 ml 4 % (Gew./Vol.) Paraformaldehyd (PFA) gegeben, um sie über Nacht zu fixieren. Die fixierte Kollagen/Fibroblasten-Matrix wurde vom CRUK Edinburgh Centre Pathology & Phenomics Lab in Wachs eingebettet, geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt. Gefärbte Schnitte wurden auf dem Nanozoomer XR-Modell abgebildet, die Daten wurden mit NDP Scan v 3.1 erfasst. 40-fache Vergrößerung.

Frisch entkernte Schweineaugen wurden beim örtlichen Metzger gekauft. Um eine Hornhautverletzung hervorzurufen, wurde mit einer 5-mm-Biopsiestanze ein teilweiser Schnitt in die zentrale Hornhaut bis zu einer Tiefe von etwa 50 % vorgenommen. Dann wurde eine Lösung aus methacryliertem Seidenfibroin (15 oder 20 Gew.-%), die 0,5 % (Gew./Vol.) Lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat (LAP) enthielt, bis zum Defekt gefüllt und 5 Minuten lang photovernetzt (365 nm, 3 mW/cm2). Frische Hornhaut, verletzte Hornhaut und mit Seidenfibroin-Hydrogel reparierte Hornhaut wurden dann wie zuvor beschrieben mit OCT zur Wellenlängenmessung abgebildet. Der Speichermodul (G) frisch hergestellter Silk-MA-Hydrogele wurde im Oszillationsmodus bei 32 °C unter Verwendung einer Platte-Platte-Geometrie (Kinexus Pro+, Malvern, UK) gemessen. Nach Durchführung eines Amplitudendurchlaufs zur Bestimmung des linearen viskoelastischen Bereichs (LVER) wurde ein Frequenzdurchlauf bei 0,5 % Scherdehnung durchgeführt. Die Experimente wurden dreifach durchgeführt.

Um das Konzept der Vibrationselastographie zu demonstrieren, wurde eine Reihe von FEM-Simulationen durchgeführt, wie in Abb. 6 zusammengefasst. Dies wurde mit code_aster43 auf einem Netz durchgeführt, das eine 24-Well-Polystyrolplatte und heterogenes Gel enthielt, wobei eine dynamische Last axial auf eine Ecke ausgeübt wurde der Platte. Auf der Mittelebene des Gels befanden sich 36.000 Knoten mit einer Dicke von 2 mm und einem Durchmesser von 10 mm, deren Positionen alle 10 μs über eine Gesamtsimulationszeit von 5 ms abgetastet wurden. Das zur Stimulation verwendete Belastungssignal war \(\sin (2\pi ft)/t\), wobei f = 2 kHz, wobei die gegenüberliegende Ecke als Randbedingung festgelegt war – andere Lastkombinationen wurden ebenfalls mit ähnlichen resultierenden Verschiebungsfeldern getestet und Schätzungen.

a Zeigt das auf der Basis einer Vertiefung sitzende Gel. b Zeigt die Verschiebungsgrößen der Platte bei t = 2 ms und t = 4 ms. c Zeigt die auf eine Ecke der Platte ausgeübte Anregungskraft: eine 2-kHz-Sinuskurve mit exponentiell abfallender Amplitude. d Zeigt beispielhaft die unterschiedlichen Verschiebungen in axialer Richtung in der Mitte des Gels. e Zeigt die geschätzte Wellenlänge über der Geloberfläche und die Grundwahrheit unter der Annahme von Scherwellen von 2 kHz. Panel f sind Profildiagramme mit den in e angegebenen Linien.

Die Wellenlängen aller resultierenden elastischen Wellen in diesem rauschfreien Fall wurden mithilfe von Gl. (6). Zunächst wurden die axialen Positionen zu jedem Zeitpunkt auf ein polares Gitter mit Ursprung in der Mitte des Gels übertragen, sodass die Spannungen entlang effektiver Querschnitte geschätzt wurden, wie sie im experimentellen Abschnitt verwendet wurden. Die Schätzung aus Gl. (6) wurde auf die 400 Verschiebungsfelder (Differenzpositionsfelder) zwischen t = [1, 4] ms angewendet. Schließlich wurden diese Wellenlängen auf einem kartesischen Gitter neu abgetastet, um ein Bild zu erzeugen.

Wir verwenden eine Variante der Blonski44-Kantenmethode, die auch von Lit. übernommen wurde. 31 für die räumliche Auflösung: Zuerst die Sigmoidfunktion anpassen

mit dem Levenberg-Marquardt-Algorithmus für die Parameter (L, k, x0, C) und dann die Halbwertsbreite (FWHM) der Sigmoidableitung ermitteln, die ausgedrückt werden kann als

Wir haben eine einfaktorielle ANOVA gefolgt von einem Tukey-Kramer-Test in Matlab (The Mathworks) verwendet, um auf signifikante Unterschiede mit p-Werten <0,01 oder <0,05 und einer Stichprobenanzahl N > 3 zu testen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die während der aktuellen Studie erstellten und/oder analysierten optischen Kohärenztomographie-Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Der Messdatensatz hinter den Balkendiagrammen ist auf figshare zu finden. https://doi.org/10.6084/m9.figshare.22148093.v3.

Die Matlab-Codes zur Implementierung der in diesem Dokument beschriebenen Algorithmen sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Guimarães, CF, Gasperini, L., Marques, AP & Reis, RL Die Steifheit lebender Gewebe und ihre Auswirkungen auf das Tissue Engineering. Nat. Rev. Mater. 5, 351–370 (2020).

Artikel Google Scholar

Wall, M. et al. Wichtige Entwicklungen, die das Gebiet der Mechanobiologie und Mechanotransduktion beeinflussten. J. Orthop. Res. 36, 605–619 (2018).

PubMed Google Scholar

Mullender, M. et al. Mechanotransduktion von Knochenzellen in vitro: Mechanobiologie von Knochengewebe. Med. Biol. Ing. Berechnen. 42, 14–21 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Klein, TJ, Malda, J., Sah, RL & Hutmacher, DW Tissue Engineering von Gelenkknorpel mit biomimetischen Zonen. Gewebe-Ing. B Rev. 15, 143–157 (2009).

Artikel CAS Google Scholar

Khoshgoftar, M., Wilson, W., Ito, K. & van Donkelaar, CC Die Auswirkung biomechanischer und biochemischer Eigenschaften von durch Gewebezüchtung hergestelltem Knorpel auf sein mechanisches Verhalten nach der Implantation. Biomechanik. Modell. Mechanobiol. 12, 43–54 (2013).

Artikel Google Scholar

Baas, E., Kuiper, JH, Yang, Y., Wood, MA & El Haj, AJ Das In-vitro-Knochenwachstum reagiert auf lokale mechanische Belastung in dreidimensionalen Polymergerüsten. J. Biomechanik. 43, 733–739 (2010).

Artikel Google Scholar

Luo, L., Chu, JYJ, Eswaramoorthy, R., Mulhall, KJ & Kelly, DJ Gewebe entwickeln, das die zonale Natur des Gelenkknorpels nachahmt, unter Verwendung dezellularisierter Knorpelexplantate, die mit adulten Stammzellen besiedelt sind. ACS Biomater. Wissenschaft. Ing. 3, 1933–1943 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Luo, L., Thorpe, SD, Buckley, CT & Kelly, DJ Die Auswirkungen dynamischer Kompression auf die Entwicklung von Knorpeltransplantaten, die unter Verwendung von Stammzellen aus Knochenmark und infrapatellarem Fettpolster hergestellt wurden. Biomed. Mater. 10, 055011 (2015).

Artikel PubMed Google Scholar

Luo, L., O'Reilly, AR, Thorpe, SD, Buckley, CT & Kelly, DJ Entwicklung von zonalem Knorpelgewebe durch Modulation des Sauerstoffgehalts und mechanischer Signale durch die Tiefe von mit Stammzellen beladenen Hydrogelen im infrapatellaren Fettpolster. J. Tissue Eng. Regen. Med. 11, 2613–2628 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Suresh, S. Elastische Hinweise bei der Krebserkennung. Nat. Nanotechnologie. 2, 748–749 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Xu, X., Farach-Carson, MC & Jia, X. Dreidimensionale In-vitro-Tumormodelle für die Krebsforschung und Arzneimittelbewertung. Biotechnologie. Adv. 32, 1256–1268 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xu, M., Lerner, AL, Funkenbusch, PD, Richhariya, A. & Yoon, G. Empfindlichkeit des biomechanischen und optischen Verhaltens der Hornhaut gegenüber Materialparametern unter Verwendung der Methode der Versuchsplanung. Berechnen. Methoden Biomechan. Biomed. Ing. 21, 287–296 (2018).

Artikel Google Scholar

Nguyen, BV et al. Biomechanische Eigenschaften einzelner Chondrozyten und Chondrons, bestimmt durch Mikromanipulation und Finite-Elemente-Modellierung. JR Soc. Schnittstelle 7, 1723–1733 (2010).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Nguyen, BV et al. Dehnungsabhängiges viskoelastisches Verhalten und Bruchkraft einzelner Chondrozyten und Chondronen unter Kompression. Biotechnologie. Lette. 31, 803–809 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Krouskop, TA, Dougherty, DR & Vinson, FS Ein gepulstes Doppler-Ultraschallsystem zur nichtinvasiven Messung der mechanischen Eigenschaften von Weichgewebe. J. Rehabil. Res. Entwickler 24, 1–8 (1987).

CAS PubMed Google Scholar

Muthupillai, R. et al. Magnetresonanz-Elastographie durch direkte Visualisierung sich ausbreitender akustischer Dehnungswellen. Science 269, 1854–1857 (1995).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kennedy, BF, Wijesinghe, P. & Sampson, DD Die Entstehung der optischen Elastographie in der Biomedizin. Nat. Photon. 11, 215–221 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Fujimoto, JG, Pitris, C., Boppart, SA & Brezinski, ME Optische Kohärenztomographie: eine aufstrebende Technologie für biomedizinische Bildgebung und optische Biopsie. Neoplasia 2, 9–25 (2000).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wojtkowski, M. et al. Ultrahochauflösende, schnelle Fourier-Domänen-Kohärenztomographie und Methoden zur Dispersionskompensation. Optics Express 12, 2404–2422 (2004).

Artikel PubMed Google Scholar

Zvyagin, AV, Smith, EDJ & Sampson, DD Verzögerungs- und Dispersionseigenschaften einer optischen Verzögerungsleitung im Frequenzbereich für die Rasterinterferometrie. J. Opt. Soc. Bin. A 20, 333 (2003).

Artikel Google Scholar

Rogowska, J. Optische Kohärenztomographie-Elastographietechnik zur Messung der Verformung und Belastung von atherosklerotischem Gewebe. Herz 90, 556–562 (2004).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chan, R. et al. OCT-basierte arterielle Elastographie: robuste Schätzung unter Ausnutzung der Gewebebiomechanik. Optics Express 12, 4558 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wang, RK, Kirkpatrick, S. & Hinds, M. Phasenempfindliche optische Kohärenz-Elastographie zur Kartierung von Gewebemikrodehnungen in Echtzeit. Appl. Physik. Lette. 90, 164105 (2007).

Artikel Google Scholar

Larin, KV & Sampson, DD Optische Kohärenz-Elastographie – OCT bei der Arbeit in der Gewebebiomechanik [Eingeladen]. Biomed. Optics Express 8, 1172–1202 (2017).

Artikel Google Scholar

Wang, S. & Larin, KV Scherwellenbildgebende optische Kohärenztomographie (SWI-OCT) für die Biomechanik des Augengewebes. Optik Lett. 39, 41 (2014).

Artikel CAS Google Scholar

Rajput, S. & Thakur, NK In Geological Controls for Gas Hydrate Formations and Unconventionals 131–164 (Elsevier, 2016).

Ramier, A. et al. In-vivo-Messung des Schermoduls der menschlichen Hornhaut mittels optischer Kohärenz-Elastographie. Wissenschaft. Rep. 10, 17366 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gallot, T. et al. Passive Elastographie: Scherwellentomographie aus physiologischer Geräuschkorrelation in Weichteilen. IEEE Trans. Ultraschall, Ferroelektrika Frequenzkontrolle 58, 1122–1126 (2011).

Artikel Google Scholar

Catheline, S. et al. Tomographie aus diffusen Wellen: Passive Scherwellenbildgebung mit Scannern mit niedriger Bildrate. Appl. Physik. Lette. 103, 014101 (2013).

Artikel Google Scholar

Nguyen, T.-M. et al. Diffuse Scherwellenbildgebung: Hin zur passiven Elastographie unter Verwendung der optischen Kohärenztomographie im Spektralbereich mit niedriger Bildrate. J. Biomed. Optics 21, 126013 (2016).

Artikel Google Scholar

Zvietcovich, F., Pongchalee, P., Meemon, P., Rolland, JP & Parker, KJ Reverberant 3D Optical Kohärence Elastography bildet die Elastizität einzelner Hornhautschichten ab. Nat. Komm. 10, 4895 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Hyle Park, B. et al. Echtzeit-faserbasierte multifunktionale optische Kohärenztomographie im Spektralbereich bei 13 μm. Optics Express 13, 3931 (2005).

Artikel Google Scholar

Kennedy, BF et al. Dehnungsschätzung in der phasenempfindlichen optischen Kohärenzelastographie. Biomed. Optics Express 3, 1865 (2012).

Artikel Google Scholar

Hochmuth, RM Mikropipettenaspiration lebender Zellen. J. Biomechanik. 33, 15–22 (2000).

Artikel CAS Google Scholar

Yanez, LZ, Han, J., Behr, BB, Pera, RAR & Camarillo, DB Das Entwicklungspotenzial menschlicher Eizellen wird durch mechanische Eigenschaften innerhalb von Stunden nach der Befruchtung vorhergesagt. Nat. Komm. 7, 10809 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wen, D. et al. Die Histonvariante H3.3 ist ein wesentlicher mütterlicher Faktor für die Neuprogrammierung der Eizelle. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 111, 7325–7330 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Grasland-Mongrain, P. et al. Ultraschnelle Darstellung der Zellelastizität mit optischer Mikroelastographie. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 115, 861–866 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sabra, KG, Conti, S., Roux, P. & Kuperman, WA Passive In-vivo-Elastographie aus Skelettmuskelgeräuschen. Appl. Physik. Lette. 90, 194101 (2007).

Artikel Google Scholar

Sun, M. & Star-Lack, JM Verbesserte Streukorrektur durch adaptive Streukernüberlagerung. Physik. Med. Biol. 55, 6695–6720 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yan, Y. et al. Mechanische Charakterisierung von Agarose-Mikropartikeln mit enger Größenverteilung. Pulvertechnologie. 192, 122–130 (2009).

Artikel CAS Google Scholar

Timpson, P. et al. Organotypischer Kollagen-I-Assay: eine formbare Plattform zur Beurteilung des Zellverhaltens in einem dreidimensionalen Kontext. J. Vis. Exp. http://www.jove.com/details.php?id=3089 (2011).

Hallas-Potts, A., Dawson, JC & Herrington, CS Eierstockkrebs-Zelllinien, die aus nicht-serösen Karzinomen stammen, wandern und dringen aggressiver ein als solche, die aus hochgradigen serösen Karzinomen stammen. Wissenschaft. Rep. 9, 5515 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Electricité de France. Finite-Elemente-Code_aster, Analyse von Strukturen und Thermomechanik für Studien und Forschung. Open Source auf www.code-aster.org (2019).

Blonski, S., Pagnutti, MA, Ryan, R. & Zanoni, V. Kantenreaktionsmessungen während des Fluges für Fernerkundungssysteme mit hoher räumlicher Auflösung. Proz. SPIE 4814, 317–326 (2002).

Referenzen herunterladen

Wir möchten AJEH für die Unterstützung durch einen ERC Advanced Award danken; 638836: H2020_ERC_DYNACEUTICS und der MRC UKRMP Hub Engineering der Zellumgebung.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Jonathan H. Mason, Lu Luo.

MRC Centre for Regenerative Medicine, The University of Edinburgh, Edinburgh, Großbritannien

Jonathan H. Mason, Amelia Hallas-Potts, Vlastimil Sørsen und Pierre O. Bagnaninchi

Healthcare Technology Institute, University of Birmingham, Birmingham, Großbritannien

Lu Luo & Alicia J. El Haj

Fakultät für Ingenieurwissenschaften, Nottingham Trent University, Nottingham, Großbritannien

Yvonne Reinwald

Mathematisches Institut, Universität Oxford, Oxford, Großbritannien

Matteo Taffetani & Sarah Waters

Cancer Research UK Edinburgh Centre, Universität Edinburgh, Edinburgh, Großbritannien

Amelia Hallas-Potts & C. Simon Herrington

MRC Centre for Reproductive Health, The University of Edinburgh, Edinburgh, Großbritannien

Chih-Jen Lin

School of Chemical Engineering, University of Birmingham, Birmingham, Großbritannien

Inês A. Barroso, Zhihua Zhang, Zhibing Zhang und Anita K. Ghag

Institut für Wissenschaft und Technologie in der Medizin, Keele University, Stoke-on-Trent, Großbritannien

Ying Yang

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JHM, LL, YR, YY, SW, AJEH und PB haben die Studie und die Experimente entworfen und die Arbeit geschrieben. JHM hat den Algorithmus geschrieben. JHM und LL haben OCT-Scans erstellt. JHM, LL, YR, MF, AHP, VS, CJL, IAB, ZZ und AKG führten die Experimente durch. JHM, LL, CSH, AJEH und PB analysierten die Daten.

Korrespondenz mit Alice J. El Haj oder Pierre O. Bagnaninchi.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Stefan Catheline und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptherausgeber: Alexander Cartagena-Rivera, Anam Akhtar und Christina Karlsson Rosenthal.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Mason, JH, Luo, L., Reinwald, Y. et al. Optische Kohärenz-Elastographie mit verzerrten Umgebungsschwingungen zur Profilierung der mechanischen Eigenschaften von Zellen, Organoiden und Gewebe. Commun Biol 6, 543 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04788-0

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Eingegangen: 13. September 2021

Angenommen: 31. März 2023

Veröffentlicht: 18. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04788-0

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