Atomistische Modellierung von Flüssigkeiten

Jul 01, 2023

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 886 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Flüssig-Flüssig-Phasentrennung von Proteinlösungen hat aufgrund ihrer biologischen Bedeutung und pathogenen Relevanz wieder erhöhte Aufmerksamkeit erlangt. Grobkörnige Modelle sind bei der Erklärung von Rückstandseffekten auf das Phasengleichgewicht begrenzt. Hier berichten wir über Phasendiagramme für γ-Kristalline mithilfe atomistischer Modellierung. Die Berechnungen wurden durch die Kombination unserer FMAP-Methode zur Berechnung chemischer Potentiale und Brownscher Dynamiksimulationen zur Konfigurationsprobenahme dichter Proteinlösungen ermöglicht, wodurch die binodale und kritische Temperatur (Tc) ermittelt wurde. Wir erhalten einen höheren Tc-Wert für ein bekanntes γ-Kristallin mit hohem Tc-Wert, γF, als für ein Paralog mit niedrigem Tc-Wert, γB. Der Unterschied im Tc wird durch eine Lücke im zweiten Virialkoeffizienten bestätigt. Die Aufschlüsselung der Wechselwirkungen zwischen Proteinen zeigt, dass eine Aminosäuresubstitution zwischen γB und γF, von Ser zu Trp an Position 130, den Hauptgrund für den Tc-Unterschied darstellt. Diese Art der Analyse ermöglicht es uns, das Phasengleichgewicht mit der Aminosäuresequenz zu verknüpfen und Mutationen zur Veränderung des Phasengleichgewichts zu entwerfen.

Die Flüssig-Flüssig-Phasentrennung von Proteinen wurde in den letzten Jahren intensiv untersucht, da die resultierenden biomolekularen Kondensate sowohl eine Vielzahl zellulärer Prozesse vermitteln, die von der Transkription bis zur Stressregulation reichen, als auch anfällig für krankheitsbedingte Aggregation sind1,2,3. Die meiste Aufmerksamkeit wurde auf intrinsisch ungeordnete Proteine ​​(IDPs) oder Proteine ​​mit langen ungeordneten Regionen gerichtet, teilweise aufgrund der starken Tendenz solcher Proteine, eine Phasentrennung zu durchlaufen4,5,6,7,8,9,10,11. Diese Tendenz ergibt sich aus der Tatsache, dass die intrinsische Störung es den Proteinen ermöglicht, leicht multivalente Wechselwirkungen zu bilden, die die Phasentrennung vorantreiben12. Ironischerweise wurde die Phasentrennung erstmals bei strukturierten Proteinen beobachtet, darunter γ-Kristallinen13,14, die in hohen Konzentrationen in der Augenlinse von Tieren vorhanden sind. Bei strukturierten Proteinen erfordert die Bildung multivalenter Wechselwirkungen, die die Phasentrennung vorantreiben, hohe Konzentrationen12. Folglich ist die Phasentrennung strukturierter Proteine ​​durch eine hohe Sättigungskonzentration und/oder eine niedrige kritische Temperatur (Tc) gekennzeichnet, was beides Schwierigkeiten für experimentelle Untersuchungen darstellt. Während die Sequenzdeterminanten für die Phasentrennung ungeordneter Proteine ​​gut untersucht sind5,7,10,11, ist unser Verständnis dieses entscheidenden Themas für strukturierte Proteine ​​noch unzureichend.

In Linsen von Rindern, Ratten und Menschen wurden jeweils bis zu sechs hochhomologe γ-Kristalline identifiziert 15, 16, 17 (Abb. 1a und ergänzende Abb. 1a). Entsprechend ihren Tc-Werten für die Phasentrennung können sie in zwei Gruppen eingeteilt werden: Die eine, repräsentiert durch Rinder-γB, hat einen Tc-Wert unter 10 °C; der andere, repräsentiert durch bovines γF, hat Tc etwa bei Körpertemperatur14,18,19. γ-Kristalline mit hohem Tc sind im Linsenkern in einer höheren Konzentration vorhanden als in der Kortikalis und tragen zum Gradienten des Brechungsindex bei14,18. Die Phasentrennung von γ-Kristallinen kann zu Katarakt führen und wird durch andere Komponenten wie β-Kristalline20 unterdrückt. Beim Abkühlen einer Rattenlinse wurde eine Phasentrennung beobachtet, ein Phänomen, das als kalter Katarakt bekannt ist21. Die Auswirkungen mehrerer Katarakt-verursachender Punktmutationen auf die Phasentrennung wurden untersucht; Die daraus resultierenden Veränderungen in Tc, z. B. durch R14C (in Gegenwart eines Reduktionsmittels zur Verhinderung der Disulfidvernetzung) und E107A von menschlichem γD, waren gering22,23.

a Sequenzausrichtung von γB und γF. Die Restzahlen entsprechen γB. Der Unterschied an Position 130 wird durch grüne und orange Farben für die Aminosäuren S und W in γB bzw. γF hervorgehoben. Der Linker zwischen den beiden Domänen ist in Kleinbuchstaben angegeben. Die Sequenzen wurden aus den UniProt-Einträgen (https://www.uniprot.org/) P02526 und P23005 für γB bzw. γF abgerufen und mit ClustalW58 abgeglichen. Die Ausrichtung aller bekannten Sequenzen von γ-Kristallinen von Rindern, Menschen und Ratten ist in der ergänzenden Abbildung 1a dargestellt. b Überlagerung von γB- und γF-Kristallstrukturen (PDB-Einträge 1AMM und 1A45). γB und γF werden in der Cartoon-Darstellung in Grün bzw. Blau dargestellt; Seitenketten an Position 130 sind für γB als Kugel-Stab-Struktur und für γF als Stäbchen-Struktur dargestellt.

Angesichts der 82 %igen Sequenzidentität zwischen Rinder-γB und γF (Abb. 1a) ist die große Lücke zwischen ihren Tc-Werten erstaunlich und wirft die Frage nach ihren Sequenzdeterminanten auf . Der erste Strukturvergleich zwischen diesen beiden Proteinen24 zeigte ebenfalls eine hohe Ähnlichkeit [Abb. 1b; 0,19 Å quadratische Abweichung (RMSD) für alle Grundgerüstatome]; Die Autoren schlugen Unterschiede im Kristallkontakt und in der Schleifenkonformation (Reste 116–122) als mögliche Ursachen für die Tc-Lücke vor. Basierend auf einem Sequenzvergleich haben Broide et al. 19 schlugen die Aminosäuresubstitutionen an den Positionen 22 und 47 als potenzielle, 15 als mögliche und 163 als weniger wahrscheinliche Determinanten vor. Norledge et al. 15 stellte fest, dass diese früheren Versuche durch ungenaue Sequenzen behindert wurden, da die untersuchten γ-Kristalline aus Rinderlinsen isoliert und als unterschiedliche Fraktionen gesammelt wurden und ihre Sequenzen nicht verifiziert wurden. Sie führten die Tc-Lücke auf Unterschiede in der Gesamtoberflächenladung zurück, einschließlich eines höheren Arg/Lys-Verhältnisses und eines höheren His-Gehalts in der Gruppe mit hohem Tc-Gehalt. Dieser Versuch hatte jedoch ein eigenes Handicap, nämlich die Einstufung von γD bei Menschen und Ratten als hoch-Tc; Nachfolgende Studien haben gezeigt, dass sowohl menschliches als auch Ratten-γD, genau wie Rinder-γD19, zur Gruppe mit niedrigem Tc-Gehalt gehören22,25. Augusteyn et al. 26 maßen die Tryptophan-Fluoreszenzlöschung verschiedener boviner γ-Kristallin-Fraktionen. Zur letztgenannten Studie äußerten sich Norledge et al. 15 stellte fest, dass „ihre Aufteilung der Rinder-γ-Kristalline in zwei Gruppen auf der Grundlage der Tryptophan-Fluoreszenz mit der Aufteilung in zwei Gruppen auf der Grundlage des Phasentrennungsverhaltens übereinstimmt“, und führte dies auf die leichte Löschung der Fluoreszenz der Gruppe mit hohem Tc-Wert zurück an einen freigelegten Trp-Rest an Position 130 (Abb. 1b). Sie brachten Trp130 jedoch nicht mit einem hohen Tc-Wert in Verbindung.

Die Binodale, d. h. die Temperaturabhängigkeit der Proteinkonzentrationen in den gleichzeitig vorhandenen verdünnten und dichten Phasen, gemessen in Lit. 19 für Rinder-γ-Kristalline haben eine Reihe rechnerischer Studien motiviert. Dorsaz et al. 27 verwendeten kugelförmige Partikel, die über ein Quadrattopfpotential interagieren, um γ-Kristalline zu modellieren. Kastelic et al. 28 erweiterte ein solches Modell um Interaktionsstellen auf der Kugeloberfläche. Mit grobkörnigen Modellen gelingt es zunehmend, die Auswirkungen großer Sequenzvariationen (z. B. Substitutionen aller Tyr-Reste durch Phe) auf die Phasengleichgewichte von IDPs zu reproduzieren6,8,9, aber die quantitative Vorhersage der Auswirkung einer Punktmutation scheint nicht möglich Reichweite dieser Modelle, insbesondere für strukturierte Proteine. Da wir die Grenzen dieser vereinfachten Modelle erkannten, entwickelten wir eine Methode namens FMAP (Fast Fourier Transform (FFT))-basierte Modellierung atomistischer Protein-Protein-Wechselwirkungen und demonstrierten deren Machbarkeit für die Untersuchung der Phasentrennung für γ-Kristalline und andere Proteine29 (siehe Ergänzung). Anmerkung 1 und ergänzende Abbildung 2). Die Leistungsfähigkeit der FFT ermöglicht es FMAP, einen großen Rechenaufwand zu bewältigen, der zur Bestimmung der Binodale eines atomistischen Proteins erforderlich ist. Der FFT-basierte Ansatz wurde auch zur Berechnung der zweiten Virialkoeffizienten30 verwendet, die ein Indikator für die kritische Temperatur sind31.

Hier kombinieren wir FMAP mit Brownschen Dynamiksimulationen für die Konfigurationsprobenahme dichter Proteinlösungen, um die Binodale von Rinder-γB und γF zu bestimmen und den Ursprung ihrer Tc-Lücke zu identifizieren. Unsere restspezifische Zerlegung der Interprotein-Wechselwirkungen und die Sequenzanalyse zeigen, dass die Substitution von Ser in γB zu Trp in γF an Position 130 (Abb. 1b) den Hauptgrund für die Tc-Lücke darstellt. Diese Arbeit demonstriert einen rechnerischen Ansatz zur Abbildung des Phasengleichgewichts auf die Aminosäuresequenz für strukturierte Proteine ​​und eröffnet die Möglichkeit, Mutationen zu entwerfen, um das Phasengleichgewicht zu verändern.

Das chemische Potenzial \(\mu\) ist die freie Energie pro Molekül. Für eine Proteinlösung ermöglicht die Abhängigkeit des chemischen Potentials von der Proteinkonzentration (\(\rho\)) die Bestimmung des Binodals12,32. \(\mu\) kann zerlegt werden in

Der ideale Teil \({\mu }_{{{{{{\rm{id}}}}}}}\) ist das chemische Potenzial einer idealen Lösung, in der die Proteinmoleküle überhaupt keine Wechselwirkungen haben und ist das gleiche wie das Gegenstück eines idealen Gases,

wobei \({k}_{{{{{{\rm{B}}}}}}}\) die Boltzmann-Konstante ist, \(T\) die absolute Temperatur ist und \({\rho }_{0} \) ist eine beliebige Referenzkonzentration. Der überschüssige Teil \({\mu }_{{{{{{\rm{ex}}}}}}}\) erklärt Wechselwirkungen zwischen den Proteinmolekülen in der Lösung. Während eine niedrige Konzentration \({\mu }_{{{{{\rm{id}}}}}}}\) verringert (wie durch Gleichung [2] vorgegeben), können intermolekulare Wechselwirkungen bei hohen Proteinkonzentrationen abnehmen. ({\mu }_{{{{{{\rm{ex}}}}}}}\). Zwei koexistierende Phasen müssen das gleiche chemische Potenzial haben. Der einfache Grund dafür, dass eine Proteinlösung eine Phasentrennung erfährt, ist also, dass \({\mu }_{{{{{{\rm{id}}}}}}}\) die verdünnte Phase bevorzugt, während \({\mu } _{{{{{{\rm{ex}}}}}}}\) begünstigt die dichte Phase, was zu einem gleichen chemischen Potenzial zwischen den Phasen führt.

Eine Möglichkeit, \({\mu }_{{{{{\rm{ex}}}}}}}\) zu formulieren, besteht in der Einführung eines Testproteins, das mit den Proteinmolekülen in der Lösung identisch ist. einschließlich der gleichen intermolekularen Wechselwirkungen, hat jedoch keinen Einfluss auf die Proteinlösung. Wenn wir jedes Proteinmolekül als starr betrachten, ermöglichen die Position und Ausrichtung des Proteinmoleküls die Angabe der Positionen aller seiner Atome. Sei \({{{{\bf{R}}}}}}\) und \({{{{{\boldsymbol{\Omega }}}}}}\) jeweils die Position und Orientierung von das Testprotein, \({{{{\bf{X}}}}}}\) seien die Konfigurationen der Proteinmoleküle in der Lösung und \(U\left({{{{{\bf{X }}}}}},{{{{{\boldsymbol{\Omega }}}}}},{{{{{\bf{R}}}}}}\right)\) sei die Wechselwirkungsenergie zwischen den Testprotein und Proteinlösung, dann ist das überschüssige chemische Potenzial durch33 gegeben

wobei \(\beta =1/{k}_{{{{{{\rm{B}}}}}}}T\) und \(\left\langle \cdots \right\rangle\) eine Mittelung über bedeutet \({{{{\bf{X}}}}}}\), \({{{{{\boldsymbol{\Omega }}}}}}\) und \({{{{{\ bf{R}}}}}}\).

Für Proteine, die auf atomarer Ebene modelliert werden, erfordert die Auswertung von \({\mu }_{{{{{{\rm{ex}}}}}}}\) einen enormen Rechenaufwand, der Stichproben über \({ {{{{\bf{X}}}}}}\), \({{{{{\boldsymbol{\Omega }}}}}}\) und \({{{{{\bf{R }}}}}}\). Beispielsweise erfordert die Probenahme über \({{{{\bf{R}}}}}}\) das Platzieren des Testproteins (mit einer bestimmten Ausrichtung \({{{{{\boldsymbol{\Omega }}} }}}\)) in zahlreiche Positionen innerhalb einer Proteinlösung (mit einer bestimmten Konfiguration \({{{{\bf{X}}}}}}\)), wie in Abb. 2a dargestellt. Unsere FFT-basierte Methode, hier FMAPμ genannt, beschleunigt die Mittelung über \({{{{{\bf{R}}}}}}\) und macht dadurch die Auswertung von \({\mu }_{{{{ {{\rm{ex}}}}}}}\) machbar29. Unsere Wechselwirkungsenergiefunktion besteht aus additiven Beiträgen aller Atompaare zwischen zwei beliebigen Proteinmolekülen. Der Beitrag jedes Atompaares i und j hat drei Terme29,34:

wobei \({r}_{{ij}}\) der interatomare Abstand ist. Der sterische Begriff ist

wobei \({\sigma }_{{ii}}/2\) den Kernradius des Atoms \(i\) bezeichnet. Der Term der unpolaren Anziehung, einschließlich Van-der-Waals-Wechselwirkungen und hydrophober Wechselwirkungen, hat die Form eines Lennard-Jones-Potentials.

Dabei bezeichnet \({\epsilon }_{{ij}}\) die Größe der \(ij\)-Anziehung, \({\sigma }_{{ij}}\) den Abstand, bei dem die unpolare Wechselwirkungsenergie auftritt ist Null. Wie in unseren vorherigen Studien29,34 verwendeten wir AMBER-Parameter für \({\epsilon }_{{ij}}\) und \({\sigma }_{{ij}}\) zusammen mit einem Skalierungsparameter \( {s}_{1}\) = 0,16. Der elektrostatische Term hat die Form eines Debye-Hückel-Potenzials,

Dabei ist \({q}_{i}\) die Teilladung des Atoms \(i\), \(\varepsilon\) die Dielektrizitätskonstante und \(\kappa\) der Debye-Screening-Parameter. Wir haben einen Skalierungsfaktor \({s}_{2}\) = 1,6 eingeführt, um Effekte wie eine mögliche Verringerung der Dielektrizitätskonstante in dichten Proteinlösungen zu berücksichtigen29.

a Illustration der FMAPμ-Methode. Drei Kästchen mit unterschiedlichen Kopienzahlen des rot dargestellten Proteins zeigen einen Konzentrationsbereich. Bei jeder Konzentration wird eine zusätzliche Kopie oder ein Testprotein, grün dargestellt, fiktiv in das Kästchen eingefügt (angezeigt durch gestrichelte Pfeile), und ihre Wechselwirkungsenergie mit den roten Kopien wird durch FMAP berechnet. Der Durchschnitt des entsprechenden Boltzmann-Faktors ergibt das überschüssige chemische Potenzial bei dieser Proteinkonzentration. b, c Abhängigkeiten überschüssiger chemischer Potentiale von der Proteinkonzentration und der Temperatur für γB und γF. Fehlerbalken wurden durch Anwendung der Blockierungsmethode von Ref. geschätzt. 59 zum durchschnittlichen Boltzmann-Faktor bei 500 Testproteinorientierungen. Der große Fehler des chemischen Überschusspotentials von γB bei 277 mg/ml und –2 °C war auf eine einzelne austretende niedrige Wechselwirkungsenergie zurückzuführen (siehe auch ergänzende Abbildung 5). Die sterische Komponente ist die Hochtemperaturgrenze des chemischen Überschusspotentials. Ein Vergleich der sterischen Komponenten zwischen γB und γF ist in der ergänzenden Abbildung 4 dargestellt.

Die Probenahme von Proteinkonfigurationen (\({{{{\bf{X}}}}}}\)) wurde durch Simulationen der Brownschen Dynamik (BD)35 implementiert. 30–450 γB- oder γF-Moleküle wurden in einem kubischen Kasten mit einer Seitenlänge von 324 Å gestartet, was zu Konzentrationen von 31 bis 461 mg/ml führte, die den experimentell relevanten Bereich abdecken (siehe Abb. 3f, Einschub unten). Die aus den BD-Simulationen berechnete Paarverteilungsfunktion stimmt mit der aus der Paarwechselwirkungsenergie erwarteten überein (ergänzende Abbildung 3). Aus diesen Simulationen haben wir 2000 Konfigurationen in 10-ns-Intervallen genommen, um FMAPμ zu implementieren. Um \({{{{{\boldsymbol{\Omega }}}}}}\ abzutasten, haben wir 500 zufällige Orientierungen für das Testprotein generiert. Schließlich wurde die Abtastung über \({{{{\bf{R}}}}}}\) durch Diskretisierung der BD-Simulationsbox mit einer Auflösung von 0,6 Å in jeder Dimension realisiert, was zu einer Gesamtsumme von 5403 = 1,57464 × führte 108 Rasterpunkte. Insgesamt haben wir also 1,57464 × 1014 Wechselwirkungsenergien erhalten, um \({\mu }_{{{{{{\rm{ex}}}}}}}\) bei jeder Proteinkonzentration zu berechnen.

a Die Konzentrationsabhängigkeit des chemischen Überschusspotentials von γB bei −2 °C. Kreise mit Fehlerbalken sind die gleichen Rohdaten wie in Abb. 2b; Pluszeichen zeigen die Ergebnisse nach der Modellierung der kumulativen Verteilungsfunktion im Bereich niedriger Wechselwirkungsenergie an (siehe ergänzende Abbildung 5a, b zur Veranschaulichung); Die Kurve ist eine Anpassung an ein Polynom fünfter Ordnung. b Das gesamte chemische Potenzial nach Hinzufügung des idealen Teils. Die horizontale Linie halbiert das gesamte chemische Potenzial mit gleichen Flächen oben und unten; Der erste und der letzte Schnittpunkt definieren die Binodale, während die Extrema die Spinodale definieren. c Binodale und spinodale von γB, bestimmt durch FMAPμ-Berechnungen, dargestellt als gefüllte bzw. offene Kreise. Die durchgezogenen vertikalen Pfeile verbinden den ersten und letzten Schnittpunkt in (b) mit den binodalen Konzentrationen bei −2 °C; Die gestrichelten vertikalen Pfeile verbinden die Extrema des gesamten chemischen Potentials mit den spinodalen Konzentrationen bei −2 °C. Die experimentellen Binodale und Spinodale (aus Lit. 37 mit der Konzentrationskorrektur von Lit. 19) werden als gefüllte und offene Quadrate dargestellt. d Schnappschüsse von γB aus BD-Simulationen bei spinodalen Konzentrationen (123 und 400 mg/ml). Aus Gründen der Übersichtlichkeit werden nur Proteinkopien in einer Platte angezeigt, die sich über ein Viertel der Seitenlänge entlang z (in die Seite gerichtet) erstreckt. e Die γB-Ergebnisse aus Panel (a) werden hier noch einmal im Vergleich zu den Gegenstücken von γF gezeigt. f Vergleich der Binodalen von γB und γF, ermittelt durch FMAPμ-Berechnungen. Einschub: experimentelle Binodale aus Lit. 19.

In Abb. 2b, c zeigen wir die \({\mu }_{{{{{\rm{ex}}}}}}}\)-Ergebnisse für γB und γF über den oben genannten Konzentrationsbereich und bei Temperaturen von −2 °C bis 50 °C. Einige Besonderheiten bei niedrigen Temperaturen sind erwähnenswert. Erstens dominieren attraktive Wechselwirkungen den Boltzmann-Durchschnitt von Gl. [3], und daher ist \({\mu }_{{{{{{\rm{ex}}}}}}}\) negativ. Zweitens und am interessantesten ist, dass γF \({\mu }_{{{{{{\rm{ex}}}}}}}\) negativer ist als γB \({\mu }_{{{{{{ \rm{ex}}}}}}}\). Beispielsweise gilt bei \(T\) = −2 °C und \(\rho\) = 400 mg/ml, \(\beta {\mu }_{{{{{{\rm{ex}}}} }}}\) beträgt −2,3 ± 0,1 für γB, sinkt jedoch auf −3,0 ± 0,2 für γF. Der Unterschied in \({\mu }_{{{{{{\rm{ex}}}}}}}\) spiegelt stärkere anziehende Wechselwirkungen in der γF-Lösung wider und führt zu einem höheren Tc. Die rohen \({\mu }_{{{{{\rm{ex}}}}}}}\)-Ergebnisse erfassen also bereits den Hauptunterschied zwischen γB und γF im Phasengleichgewicht.

Drittens nimmt \({\mu }_{{{{{\rm{ex}}}}}}}\) mit zunehmender Konzentration zunächst ab, da immer mehr Moleküle an attraktiven Wechselwirkungen teilnehmen können. Beispielsweise nimmt für γB bei \(T\) = −2 °C \(\beta {\mu }_{{{{{{\rm{ex}}}}}}}\) von −1,27 ± ab 0,02 bei 123 mg/ml bis −2,3 ± 0,1 bei 400 mg/ml. Mit weiterer Erhöhung der Konzentration beginnt \({\mu }_{{{{{\rm{ex}}}}}}}\) sich jedoch umzudrehen, da Moleküle eine sterische Abstoßung erfahren. Schließlich können die Werte von \({\mu }_{{{{{{\rm{ex}}}}}}}\) bei den niedrigsten Temperaturen große Unsicherheiten aufweisen, wie durch \({\beta \mu }_{{{{{\rm{ex}}}}}}}\) Wert −4,7 (+2,6/−0,7) von γB bei −2 °C und 277 mg/ml. Die numerischen Unsicherheiten ergeben sich aus der allgemeinen Schwierigkeit, den niedrigsten Energiebereich eines molekularen Systems abzutasten (z. B. Lit. 4).

Wenn die Temperatur erhöht wird, werden sterische Wechselwirkungen auch bei niedrigeren Proteinkonzentrationen wichtig, wodurch die gesamte \({\mu }_{{{{{{\rm{ex}}}}}}}\)-Kurve angehoben wird. Bei T = 50 °C ist \({\mu }_{{{{{\rm{ex}}}}}}}\) selbst bei der niedrigsten Konzentration 31 mg/ml für γB positiv und wird zunächst positiv bei 184 mg/ml für γF. In dieser Situation, die für alle Temperaturen über Tc gilt, kann keine dichte Phase die gleiche Stabilität wie eine vermeintlich verdünnte Phase erreichen und daher ist keine Phasentrennung möglich. An der Grenze von T → ∞ bleibt im Boltzmann-Mittelwert von Gl. nur der sterische Term erhalten. [3]; das resultierende überschüssige chemische Potenzial, \({\mu }_{{{{{{\rm{ex}}}}}}}^{{{{{\rm{st}}}}}}}\) hängt mit dem Anteil \({f}_{{{{{\rm{CF}}}}}}}\ der Testproteinplatzierungen zusammen, die frei von sterischen Konflikten mit Proteinmolekülen in der Lösung sind . Diese Beziehung ist durch Gl. gegeben. [9] in Computermethoden. Der kollisionsfreie Anteil kann bei jeder Temperatur genau ermittelt werden. Wie in der ergänzenden Abbildung 4 gezeigt, liegen die \({f}_{{{{{\rm{CF}}}}}}}\)-Ergebnisse von γB und γF sehr nahe beieinander und liegen bei hohen Werten Konzentrationen sind um Größenordnungen höher als das Gegenstück, das wir durch den Ersatz von Lennard-Jones-Partikeln durch γB-Moleküle erhalten, wie wir es 2016 getan haben29. Die BD-Simulationen hier erfassen mit einer atomistischen Energiefunktion die Fähigkeit von Proteinmolekülen, komplexe Cluster zu bilden durch bevorzugte Wechselwirkungen stabilisiert, wodurch mehr Hohlräume für die Platzierung des Testproteins entstehen. Das übermäßig niedrige \({f}_{{{{{{\rm{CF}}}}}}}\) zusammen mit der begrenzten Abtastung in \({{{{{\boldsymbol{\Omega }}}} }}\), ist in unserer Studie von 2016 für die dort erhaltene schmale Binodale verantwortlich.

Wir haben ein Verfahren entwickelt, um numerische Unsicherheiten von \({\mu }_{{{{{{\rm{ex}}}}}}}\) zu mildern, die sich bei niedrigen Temperaturen manifestieren. Dieses Verfahren basiert auf der Beobachtung, dass die kumulative Verteilungsfunktion (CDF) der Wechselwirkungsenergie \(U\left({{{{\bf{X}}}}}},{{{{{\boldsymbol{\ Omega }}}}}},{{{{\bf{R}}}}}}\right)\) ist über 10 Größenordnungen exponentiell und deckt nahezu den gesamten negativen Bereich von \(U\) ( Ergänzende Abb. 5a, b). Das Verfahren beinhaltet das Anpassen des Logarithmus des CDF an eine lineare Funktion von \(U\) in einem Zwischenbereich von \(U\) (ergänzende Abbildung 5a, b) und die anschließende Extrapolation auf eine minimale Energie \({U}_ {{{\min }}}\) (Ergänzende Abbildungen 5a, b und 636). Wie in Abb. 3a dargestellt, ist das durch Modellierung der CDF im Bereich niedriger Wechselwirkungsenergie korrigierte \({\mu }_{{{{{\rm{ex}}}}}}}\ nun frei der großen Variationen des Originals \({\mu }_{{{{{{\rm{ex}}}}}}}\).

Anschließend addieren wir den idealen Teil zum korrigierten \({\mu }_{{{{{{\rm{ex}}}}}}}\) und führen eine flächentreue Konstruktion29,32 (Abb. 3b) durch Ermitteln Sie die Konzentrationen in den gleichzeitig vorhandenen verdünnten und dichten Phasen. Indem wir die gleichzeitig vorhandenen Konzentrationen verschiedener Temperaturen verbinden, erhalten wir die Binodale (Abb. 3c). Die flächentreue Konstruktion ergibt auch die Spinodale, die einen Konzentrationsbereich definiert, in dem das System thermodynamisch instabil ist. Wie in Abb. 3c gezeigt, stimmen die berechneten binodalen und spinodalen Werte für γB beide gut mit den experimentellen Gegenstücken aus Lit. überein. 37. Die Berechnung ergibt für γB eine kritische Temperatur von ca. 4 °C.

Bei T = −2 °C betragen die berechneten spinodalen Konzentrationen für γB 123 mg/ml am unteren Ende und 400 mg/ml am oberen Ende. In Abb. 3d zeigen wir einen Ausschnitt einer Konfiguration der γB-Lösung bei diesen Konzentrationen. Beide veranschaulichen die oben erwähnten komplexen Cluster, die wiederum durch bevorzugte Wechselwirkungen stabilisiert werden. Bei der höheren Konzentration ist die durchschnittliche Anzahl der Wechselwirkungspartner pro Molekül höher, was zu einem negativeren \({\mu }_{{{{{\rm{ex}}}}}}}\) führt, wie oben dargestellt .

In Abb. 3e vergleichen wir das Original und das korrigierte \({\mu }_{{{{{{\rm{ex}}}}}}}\) für γF bei −2 °C, zusammen mit den entsprechenden Ergebnissen für γB, die bereits in Abb. 3a gezeigt wurden. Auch hier ist \({\mu }_{{{{{{\rm{ex}}}}}}}\) für γF negativer als für γB. Schließlich präsentieren wir in Abb. 3f das berechnete Binodal für γF, das im Vergleich zum Gegenstück für γB einen höheren Tc von ~10 °C aufweist. Ähnliche Anstiege von Tc von γB auf γF werden vorhergesagt, wenn andere akzeptable Werte der Skalierungsfaktoren \({s}_{1}\) und \({s}_{2}\) in der Energiefunktion angewendet werden (Gl. [4]) (Ergänzende Anmerkung 1 und ergänzende Abbildung 7). Obwohl sich der vorhergesagte γF Tc relativ zum γB Tc in die richtige Richtung bewegt, liegt er deutlich unter dem experimentellen Wert von ~39 °C19.

Während das überschüssige chemische Potenzial \({\mu }_{{{{{{\rm{ex}}}}}}}\) durch die Wechselwirkungen zwischen allen Proteinmolekülen in einer Lösung bestimmt wird, ist der zweite Virialkoeffizient \ ({B}_{2}\) wird durch die Wechselwirkung zwischen einem Proteinmolekülpaar bestimmt. Wenn \({\mu }_{{{{{{\rm{ex}}}}}}}\) als Taylor-Reihe in \(\rho\) entwickelt wird (siehe Gleichung [19] in Computational Methods ), ist der Koeffizient erster Ordnung das Doppelte von \({B}_{2}\). \({B}_{2}\) kann ein Indikator für die kritische Temperatur sein31. Ein negativeres \({B}_{2}\) entspricht einem höheren Tc.

Wir haben den FFT-basierten Ansatz angepasst, um FMAPB2 als eine sehr robuste Methode zur Berechnung zweiter Virialkoeffizienten abzuleiten30. Die resultierenden \({B}_{2}\)-Werte von γB und γF über einen weiten Temperaturbereich sind in Abb. 4a als durchgezogene Kurven dargestellt. Es ist klar, dass γF ein negativeres \({B}_{2}\) hat und daher einen höheren Tc unterstützt. Die berechneten \({B}_{2}\)-Werte für γB stimmen gut mit den experimentellen Daten von Lit. überein. 38 (Abb. 4a Einschub).

a Temperaturabhängigkeiten von B2 für γB, γF, γBS130W und γFW130S. B2 wird in Einheiten des sterischen Volumens (Vst) des jeweiligen Proteins ausgedrückt; Vst = 0,53 × 10-4 mol ml/g3 für γB und hat für alle γ-Kristalline sehr ähnliche Werte. Für γB und γF stammen Kreise aus dem Koeffizienten erster Ordnung der Polynomanpassung (Abb. 3a, e); Durchgezogene Kurven mit passenden Farben werden mit FMAPB230 berechnet (Fehlerbalken bei 25 °C nach der Blockmethode). Die Ergebnisse für γFW130S und γBS130W sind als gestrichelte Kurven dargestellt. Gemäß einer empirischen Regel zur Bestimmung der kritischen Temperatur31 wird eine horizontale Linie mit einem Achsenabschnitt von −6 gezeichnet. Einschub: Vergleich von experimentellem und berechnetem B2 für γB. Mit SLS gekennzeichnete Symbole sind B2-Daten, die durch statische Lichtstreuung in 52,4 mM Phosphatpuffer (pH 7,1) erhalten wurden38; Eine Kurve mit einem Band zeigt die FMAPB2-Ergebnisse bei der entsprechenden Ionenstärke (0,18 ± 0,01 M). b Binodale berechnet für γFW130S und γBS130W (gestrichelte Kurven), verglichen mit denen für γB und γF (verbundene Kreise). Das Binodal von γFW130S verwendete γB-Konfigurationen und das von γBS130W verwendete γF-Konfigurationen.

Vliegenthart und Lekkerkerker31 fanden eine empirische Regel, \({B}_{2}({T}_{{{{{{\rm{c}}}}}}})/{V}_{{{{{ {\rm{st}}}}}}}\ungefähr -6\), für kugelförmige Teilchen mit sterischem Kern und attraktivem Rand, wobei \({V}_{{{{{{\rm{st}}} }}}}\) bezeichnet das Volumen des sterischen Kerns. Wir können die sterische Version von \({B}_{2}\), \({B}_{2}^{{{{{{\rm{st}}}}}}}\), verwenden wenn nur der sterische Term in der Wechselwirkungsenergiefunktion beibehalten wird, um das sterische Volumen zu definieren: \({V}_{{{{{\rm{st}}}}}}}\equiv {B}_{2 }^{{{{{{\rm{st}}}}}}}/4\). Die durch die Vliegenthart-Lekkerkerker-Regel vorhergesagten kritischen Temperaturen betragen 0 °C für γB und 6 °C für γF, was zu der gleichen Tc-Lücke führt, die aus den Binodalen bestimmt wurde (Abb. 3f). Die von FMAPB2 ermittelten Virialkoeffizienten liegen ebenfalls nahe an denen, die als Kreise dargestellt werden und aus dem Koeffizienten erster Ordnung einer abgeschnittenen Taylor-Entwicklung von \({\mu }_{{{{{{\rm{ex}}}} abgeleitet werden. }}}\) (Gl. [19]).

Um die γB-zu-γF-Substitutionen zu identifizieren, die für den Anstieg von Tc verantwortlich sind, haben wir die Paarwechselwirkungsenergien von γB- oder γF-Molekülen zerlegt. Eine solche Zersetzung wurde bereits zuvor verwendet, um für die Phasentrennung wichtige Rückstände aufzudecken39. In Abb. 5 zeigen wir die Unterschiede zwischen den entsprechenden Resten von γF und γB in ihren Beiträgen zu den jeweiligen Paarwechselwirkungsenergien. Die sechs Positionen, die den größten Beitrag zur unteren Paarwechselwirkungsenergie von γF leisten, sind in absteigender Reihenfolge: 128, 130, 84, 79, 127 und 21. Die Unterschiede in den energetischen Beiträgen an all diesen Positionen liegen über dem bei eingestellten Grenzwert Mittelwert – 3 × SD. γB und γF haben an fünf dieser Positionen die gleichen Aminosäuren: Asp21, Arg79, His84, Leu127 und Glu128. Die einzige Position, die eine Änderung der Aminosäuren mit sich bringt, ist 130, von Ser in γB zu Trp in γF. Daher zeigt die Zersetzung, dass die S130W-Substitution die Hauptursache für die Verstärkung intermolekularer Wechselwirkungen ist, was zu einem höheren Tc von γF führt.

Schwarze Balken zeigen die Unterschiede zwischen γF und γB in den restspezifischen zerlegten Wechselwirkungsenergien; Neben der linken Ordinate ist die Verteilungsfunktion der Energieunterschiede dargestellt. Die rote Kurve zeigt die verbleibenden Grantham-Distanzen; Ihre Verteilungsfunktion ist neben der rechten Ordinate dargestellt. Die gepunkteten horizontalen Linien geben ± 3-fache Standardabweichungen vom Mittelwert an, sowohl für restspezifische Energieunterschiede als auch für restliche Grantham-Abstände. Der Einschub zeigt das Sequenzlogo für die Reste 127 bis 133, berechnet anhand der Sequenzausrichtung der ergänzenden Abbildung 1. Beachten Sie, dass der Rest Gln83 von γB an einer Lücke in γF ausgerichtet ist (siehe Abb. 1). Der energetische Beitrag der γF-Position 83 wurde mit 0 angenommen und die durch Subtraktion des γB-Gegenstücks berechnete Differenz wird als grauer Balken angezeigt. Die verbleibende Grantham-Distanz an dieser Position wurde mit 0 angenommen.

Um die Rolle der S130W-Substitution zu verifizieren, haben wir die W-zu-S-Mutation in γF und die umgekehrte Mutation in γB modelliert und deren Auswirkungen berechnet. Wie in Abb. 4a gezeigt, ahmt der γFW130S-Mutant γB in \({B}_{2}\) weitgehend nach, wobei seine Größe bei niedrigen Temperaturen nur geringfügig unterschritten wird. Die γBS130W-Mutation stellt das große negative \({B}_{2}\) von γF teilweise wieder her. Ähnliche Beschreibungen gelten für die Auswirkungen der beiden Mutationen auf restspezifische Wechselwirkungsenergien zerlegter Paare. Wie in der ergänzenden Abbildung 8a gezeigt, ähneln die Unterschiede zwischen γF und γFW130S im rückstandsspezifischen Beitrag denen der Gegenstücke zwischen γF und γB (Abb. 5). Insbesondere bei Asp21 und Glu128 zusammen mit Position 130 übersteigen die γF-γFW130S-Unterschiede den Mittelwert – 3 × SD-Grenzwert. Andererseits stellt die γBS130W-Mutante die Paarwechselwirkungsenergie von γF nicht ganz wieder her; Nur der Unterschied zwischen γBS130W und γB im rückstandsspezifischen Beitrag an Position 130 überschreitet den Mittelwert – 3 × SD-Grenzwert (ergänzende Abbildung 8b).

Als ultimativen Test der Rolle der S130W-Substitution haben wir die Binodale der γFW130S- und γBS130W-Mutanten bestimmt (Abb. 4b). Der Binodalwert des γFW130S-Mutanten liegt nahe an dem von γB, während der Binodalwert des γBS130W-Mutanten dem von γF nahe kommt.

Um weitere Einblicke in die S130W-Substitution zu erhalten, haben wir die Posen mit den niedrigsten Paarwechselwirkungsenergien aus FMAPB2-Berechnungen analysiert. Wir kennzeichnen einen Partner des Paares als zentrale Kopie und den anderen Partner als Testprotein. Die Posen der Niedrigenergiepaare sind in Abb. 6a für γB und 6b für γF dargestellt. Die zentrale Kopie wird als Cartoon oder Oberfläche dargestellt und das Testprotein wird durch einen Punkt in der Mitte der Geometrie dargestellt, einer für jede Niedrigenergie-Pose. Wir definieren einen molekularen Rahmen, dessen z-Achse parallel zu seiner Schnittstelle zwischen Domänen verläuft und dessen y-Achse von der C-terminalen Domäne zur N-terminalen Domäne zeigt. Der Blick in Abb. 6a, b erfolgt in die negative x-Achse der zentralen Kopie. Eine 360°-Ansicht von Abb. 6a, b wird in den Zusatzfilmen 1 und 2 präsentiert.

a Verteilung der Konfigurationen mit der niedrigsten Wechselwirkungsenergie für γB. Oben links: 1.000 Konfigurationen mit der niedrigsten Wechselwirkungsenergie, dargestellt mit der zentralen Kopie in Cartoon-Darstellung und dem Testprotein als Punkt im Zentrum der Geometrie. Die Punkte sind entsprechend der Wechselwirkungsenergieskala im Einschub gefärbt. Oben rechts: Clusterdarstellung der 1.000 Konfigurationen. In der Struktur des energieärmsten Mitglieds jedes großen Clusters ist die Ser130-Seitenkette in Kugeldarstellung dargestellt. Unten rechts: Wie im oberen rechten Feld, außer dass die Schwellenwertclustergröße auf 2 reduziert ist. Unten links: Wie im oberen linken Feld, außer dass das Auswahlkriterium eine Obergrenze von -6 kcal/mol für die Wechselwirkungsenergie war. Die zentrale Kopie wird als Oberfläche dargestellt, während Punkte in der Mitte des Testproteins mit einer nahegelegenen Schnittebene bei 15 Å von der Mitte der zentralen Kopie angezeigt werden. b Verteilung der Konfigurationen mit der niedrigsten Wechselwirkungsenergie für γF, dargestellt auf die gleiche Weise wie in (a).

In den oberen linken Feldern von Abb. 6a, b zeigen wir die 1000 Posen mit der niedrigsten Energie. Sowohl bei γB als auch bei γF neigt das Testprotein dazu, sich an Positionen zu konzentrieren, die dem Rest 130 der zentralen Kopie zugewandt sind, diese Tendenz ist jedoch bei γF stärker. Wir haben die 1000 Posen gruppiert und die großen Cluster (≥20 Mitglieder) in den oberen rechten Feldern von Abb. 6a, b dargestellt. Jeder Cluster wird durch eine Kugel und einen Pfeil dargestellt. Die Kugel hat einen Radius proportional zur Clustergröße und ist an der Stelle mit der niedrigsten Energie in diesem Cluster zentriert. Der Pfeil verläuft entlang der Z-Achse des Molekülgerüsts des Testproteins in der letzteren Pose. Sowohl γB als auch γF haben sieben große Cluster. Für γB befinden sich sechs der sieben Cluster um Rest 130 und der siebte Cluster befindet sich hinten in der zentralen Kopie; Zusammen machen die sieben Cluster 30 % der 1000 Niedrigenergie-Posen aus. Für γF befinden sich alle sieben Cluster um Rest 130 und sammeln 47 % der 1000 Posen mit der niedrigsten Energie, was auf eine viel stärkere Präferenz für Rest 130 als Interaktionsstelle hinweist.

Wir zeigen die Clustervertreter auch anhand ihrer Molekülstrukturen in den oberen rechten Feldern von Abb. 6a, b an. Wie in der ergänzenden Abbildung 9a weiter dargestellt, bevorzugen die beiden Partner-γF-Moleküle eine parallele relative Ausrichtung, die γB-Paare jedoch eine senkrechte Ausrichtung. Während γF-Paare eine starke Tendenz zur Bildung von Grenzflächen haben, die die Trp130-Reste in beiden Partnermolekülen vergraben, kann sich γB Ser130 darüber hinaus entweder innerhalb oder außerhalb der Grenzflächen der Niedrigenergiepaare befinden.

Trp hat die sperrigste Seitenkette und besitzt das Potenzial für hydrophobe, Kation-π-, Amido-π-, π-π- und Wasserstoffbrücken-Wechselwirkungen. Die Rolle von Trp-vermittelten Kation-π-Wechselwirkungen bei der Faltungsstabilität strukturierter Proteine ​​und der Bindungsstabilität von IDPs ist allgemein bekannt40,41. Im Gegensatz dazu hat Ser nur eine kurze polare Seitenkette, wobei die Wechselwirkung auf Wasserstoffbrückenbindungen beschränkt ist. In γ-Kristallinstrukturen befindet sich der Rest 130 am Fuß der Interdomänenspalte (Abb. 1b). In Schnittstellen, die die Trp130-Reste in beiden Partnern vergraben, kann Trp130 in einem Partner mit Oberflächenresten um Trp130 des anderen Partners interagieren, einschließlich Asp21, Arg79, Leu127 und Glu128 (ergänzende Abbildung 9b). Im Gegensatz dazu ist Ser130 für γB nur begrenzt in der Lage, diese Wechselwirkungen auszubilden, selbst wenn es in einer Grenzfläche vergraben ist; Stattdessen stabilisieren andere Wechselwirkungen, beispielsweise zwischen Arg153 in einem Partner und Glu150 des anderen Partners, die Schnittstelle (ergänzende Abbildung 9c).

Die oben genannten strukturellen Unterschiede zwischen γB und γF in ihren jeweiligen Paaren können nun die energetischen Unterschiede in Abb. 5 erklären. γF-Paare bilden Grenzflächen, an denen beide Trp130-Reste vergraben sind; Wechselwirkungen zwischen Trp130 auf der einen Seite und Asp21, Arg79, His84, Leu127 und Glu128 auf der gegenüberliegenden Seite führen zu negativen Energiewerten an diesen Resten. γB-Paare können alternative Schnittstellen bilden, was die positiven Energiewerte bei Arg153 und Asp156 erklärt.

Während die Grenzflächen in den Vertretern der großen Cluster energetisch günstig sind, ist es wichtig darauf hinzuweisen, dass γB oder γF zahlreiche andere binäre Grenzflächen bilden können. Ein vollständigeres Bild ergibt sich, wenn alle Cluster mit mindestens zwei Mitgliedern einbezogen werden (unten rechts in Abb. 6a, b). Posen beginnen, den Rest der Oberfläche der zentralen Kopie zu bevölkern. Ein noch umfassenderes Bild ergibt sich, wenn alle Posen mit Paarenergien unter -6 kcal/mol einbezogen werden (unten links in Abb. 6a, b). Obwohl Trp130 eine bevorzugte Interaktionsstelle für γF ist, können auch viele andere Stellen an intermolekularen Wechselwirkungen teilnehmen, was die Bildung von Clustern über ein Dimer hinaus in einer konzentrierten Lösung ermöglicht und dadurch zu einer Phasentrennung führt. Dieses Szenario lässt sich anhand des Trp130-Trp130-Abstands zwischen zwei benachbarten γF-Molekülen gut veranschaulichen. Die Verteilung der Trp130-Trp130-Abstände in Niedrigenergiepaaren, gewichtet mit der Mayer-Funktion, weist einen hohen Peak um 10 Å auf (ergänzende Abbildung 9d), was die oben erwähnte Trp130-Trp130-Grenzfläche widerspiegelt. Trp130-Trp130-Abstände in in der dichten Phase gebildeten γF-Clustern (wie durch BD-Simulationen erfasst) zeigen immer noch einen Peak um 10 Å (ergänzende Abbildung 9e), was darauf hinweist, dass auch Trp130-Trp130-Grenzflächen gebildet werden, um die Cluster zu stabilisieren. Jenseits dieses Peaks weisen die Trp130-Trp130-Abstände jedoch eine breite Verteilung auf, was auf die Beteiligung anderer Schnittstellen hinweist. Im Vergleich dazu neigen Ser130-Ser130-Schnittstellen weniger dazu, sich in energiearmen γB-Paaren zu bilden (ergänzende Abbildung 9d) und spielen in γB-Clustern eine geringere Rolle (ergänzende Abbildung 9e).

Wir haben den Grantham-Abstand zwischen der Gruppe mit niedrigem Tc-Wert (γA, γB, γC und γD) und der Gruppe mit hohem Tc-Wert (γE und γF) an jeder Position entlang der Sequenzausrichtung in der ergänzenden Abbildung 1a berechnet. Der Grantham-Abstand misst den physikalisch-chemischen Unterschied zwischen den Seitenketten zweier Aminosäuren. Sein Quadrat ist eine gewichtete Summe quadrierter Unterschiede in drei Eigenschaften: Gruppenzusammensetzung, Polarität und Molekülvolumen. Der verbleibende Grantham-Abstand, definiert als die Differenz zwischen gruppeninternen und gruppeninternen Abständen, wird in Abb. 5 als rote Kurve dargestellt. Die Werte überschreiten den Grenzwert des Mittelwerts +3 × SD an drei Positionen: 22, 111 und 130.

In der ergänzenden Abbildung 1b vergleichen wir speziell die Aminosäuren der 15 γ-Kristalline an jeder dieser drei Positionen. An Position 22 enthält die Gruppe mit niedrigem Tc-Gehalt drei einzigartige Aminosäuren: Asn, Cys und His, während die Gruppe mit hohem Tc-Gehalt nur His enthält. Daher teilen sich die beiden Gruppen die Aminosäure His an Position 22. Eine ähnliche Situation tritt an Position 111 auf, wo die beiden Gruppen die Aminosäure Ser teilen. Nur an Position 130 haben die beiden Gruppen keine gemeinsame Aminosäure: Die Gruppe mit niedrigem Tc-Wert enthält Cys und Ser, während die Gruppe mit hohem Tc-Wert Trp und Tyr enthält, die beide aromatisch sind. Die Analyse unter Verwendung des Grantham-Abstands weist somit darauf hin, dass die Substitutionen an Position 130 den größten physikochemischen Unterschied zwischen den Gruppen mit niedrigem und hohem Tc-Wert aufweisen, von einer kurzen Seitenkette zu einer aromatischen Seitenkette. Das Sequenzlogo um Position 130 ist in Abb. 5 als Einschub dargestellt und veranschaulicht die Divergenz an Position 130 und den Konsens an benachbarten Positionen.

Die oben dargestellten energetischen Unterschiede zwischen γB und γF beschränken sich nicht nur auf die für die Berechnungen ausgewählten Protein Data Bank (PDB)-Strukturen, sondern erstrecken sich auch auf andere γ-Kristalline mit niedrigem und hohem Tc-Wert. Wir haben die FMAPB2-Berechnungen auf 13 weitere PDB-Strukturen erweitert (Abb. 7). Zusammen decken die 15 Strukturen sechs verschiedene γ-Kristalline ab; Zehn dieser Strukturen gehören zur Gruppe mit niedrigem Tc-Gehalt und die restlichen fünf gehören zur Gruppe mit hohem Tc-Gehalt. Die \({B}_{2}/{V}_{{{{{{\rm{st}}}}}}}\)-Werte betragen −1,3 ± 0,5 (Mittelwert ± SD) für den niedrigen Tc Gruppe und −2,1 ± 0,3 für die Gruppe mit hohem Tc. Die Gruppe mit hohem Tc hat einen sehr deutlich niedrigeren Mittelwert \({B}_{2}\) (P-Wert = 0,002 im ungepaarten t-Test), was mit einem viel höheren Tc übereinstimmt.

Die Bezeichnungen sind die PDB-Eintragsnamen, wobei der fünfte Buchstabe die Kette bezeichnet; Einträge mit niedrigem und hohem Tc-Wert werden in grün bzw. blau schattierten Bereichen angezeigt. Fehlerbalken werden durch die Blockierungsmethode bestimmt. „Mensch“ und „Rind“ werden mit Hum bzw. Bov abgekürzt. Ganz rechts werden Boxplots für die 10 B2 mit niedrigem Tc und die 5 B2 mit hohem Tc angezeigt.

Basierend auf umfangreichen sequentiellen, strukturellen und energetischen Analysen haben wir eine Ser-zu-Trp-Substitution an Position 130 als Hauptursache für den Tc-Unterschied zwischen γB und γF identifiziert. Diese Identifizierung bietet endlich eine Lösung für die erstmals von Siezen et al. aufgeworfene Frage. 14 vor fast 40 Jahren. Im weiteren Sinne zeigt unsere Studie, dass es nun möglich ist, die Beiträge einzelner Reste zur Energie der Phasentrennung für strukturierte Proteine ​​quantitativ zu erklären. Eine solche quantitative Charakterisierung ermöglicht es uns nicht nur zu verstehen, wie die Sequenz das Phasengleichgewicht bestimmt, sondern auch Sequenzen zu entwerfen, bei denen sich die kritische Temperatur in die gewünschte Richtung ändert.

Trp (oder Tyr) als Aminosäure, die die Phasentrennung fördert, ist für IDPs gut bekannt5,7,10. Hier zeigen wir, dass ein Austausch von Ser zu Trp eine wichtige Rolle bei der Erhöhung des Tc eines strukturierten Proteins spielt. In IDPs kann ein Trp seine Flexibilität nutzen, um eine Vielzahl intermolekularer Wechselwirkungen auszubilden, darunter hydrophobe, Kation-π-, Amido-π-, π-π- und Wasserstoffbrückenbindungen. In strukturierten Proteinen steht einem Trp das gleiche Potenzial für intermolekulare Wechselwirkungen offen, wenn man bedenkt, dass die dichte Phase durch unspezifische intermolekulare Assoziationen stabilisiert wird, die auf unzähligen Arten auftreten können.

Während die Wirkung einer S-zu-W-Mutation bei IDP kontextabhängig sein könnte, kann dies bei einem strukturierten Protein noch viel stärker der Fall sein. Beispielsweise wird erwartet, dass eine S-zu-W-Mutation an einer vergrabenen Stelle (vorausgesetzt, dass die Proteinstruktur stabil bleibt) nur geringe Auswirkungen auf die Phasentrennung hat, da der Rest nicht an intermolekularen Wechselwirkungen teilnimmt. Darüber hinaus sind nicht alle exponierten S-zu-W-Mutationen gleich. Eine S-zu-W-Mutation an einer Stelle, an der sich wahrscheinlich keine Niederenergiepaare bilden, hat möglicherweise nur einen mäßigen Effekt, eine S-zu-W-Mutation an einer bevorzugten Bindungsstelle, beispielsweise am Fuß der Interdomäne Die Spaltung von γ-Kristallinen (Abb. 6) fördert wahrscheinlich die Phasentrennung. Die S130P-Mutation von menschlichem γD hob die hitzeinduzierte Aggregation auf43, möglicherweise durch die Förderung von Dimeren, die die Rest-130-Stellen in beiden Monomeren verbergen und so eine weitere Aggregation verhindern. Wir kommen zu dem Schluss, dass der signifikante Beitrag der S130W-Substitution zu γF Tc nicht nur auf den physikochemischen Unterschieden zwischen den beiden Aminosäuren, sondern auch auf der strategischen Position des Rests 130 auf der Proteinoberfläche beruht.

Während sowohl IDPs als auch strukturierte Proteine ​​eine Phasentrennung durchlaufen können, wurde erkannt, dass IDPs dies leichter tun als strukturierte Proteine12. Im Wesentlichen erleichtert die Flexibilität von IDPs die Bildung intermolekularer Wechselwirkungen, die die dichte Phase stabilisieren. Im Gegensatz dazu erfordern strukturierte Proteine ​​hohe Konzentrationen, damit ein bestimmtes Proteinmolekül mit einer ausreichenden Anzahl von Partnermolekülen interagieren kann, um die dichte Phase stabil zu machen. Infolgedessen ist die Dichtephasenkonzentration eines strukturierten Proteins viel höher als die des Gegenstücks eines typischen IDP, was einem viel breiteren Binodal entspricht. Ein Hinweis auf diesen Konzentrationsunterschied sind die viel höheren Dichtphasenviskositäten von strukturierten oder Multidomänenproteinen im Vergleich zu IDPs44. Für γB und γF betragen die Dichtphasenkonzentrationen 400–500 mg/ml oder etwa 20 mM19. Die hier vorgestellte atomistische Modellierung erfasst gut die unzähligen Möglichkeiten, wie Proteine ​​in der dichten Phase intermolekulare Wechselwirkungen eingehen und dadurch die breiten Binodale rekapitulieren können.

Durch die Nutzung der Leistungsfähigkeit der FFT hat unser Ansatz die Herausforderung gemeistert, die sich aus dem enormen Rechenaufwand für die Bestimmung der Binodale eines atomistischen Proteins ergibt. Dennoch gibt es bei diesem Ansatz erhebliches Verbesserungspotenzial, einschließlich der Genauigkeit der Wechselwirkungsenergiefunktion und der Behandlung der Proteinflexibilität. Diese Einschränkungen sind höchstwahrscheinlich für die derzeitige Unterschätzung der Tc-Lücke zwischen γF und γB verantwortlich. Binodale reagieren empfindlich auf Energiefunktionen und bieten daher ein großes Potenzial für ihre Parametrisierung. Beispielsweise unterschätzt unsere aktuelle Energiefunktion möglicherweise die Unterscheidung zwischen Arg und Lys. Eine Substitution von Lys durch Arg an Position 163 könnte zum hohen Tc von γF15,19 beitragen; Es wurde tatsächlich festgestellt, dass solche Substitutionen in γ-Kristallinen von antarktischen Seehechtfischen einen signifikanten Einfluss auf Tc45 haben. Unsere vorläufige Berechnung unter Verwendung der Rosetta-Energiefunktion für alle Atome, die beim Andocken und Design von Proteinen weit verbreitet ist und ausgefeilter als unsere Energiefunktion ist, zeigt eine größere Lücke zwischen γF und γB in den binären Wechselwirkungsenergien (Ergänzende Anmerkung 1 und ergänzende Abbildung 10). ). Was die Flexibilität von Proteinen angeht, könnte ein wichtiger Fortschritt die Neupackung der Seitenkette als Reaktion auf die Annäherung anderer Proteinmoleküle sein. Unsere vorläufige Studie, in der RosettaDock47 zum Umpacken der Seitenketten verwendet wurde, zeigt tatsächlich eine weitere Vergrößerung der Energielücke zwischen γF und γB (Ergänzende Anmerkung 1 und ergänzende Abbildung 10). Alternativ scheint auch die Verwendung einer vorab ausgewählten Bibliothek von Proteinstrukturen in Simulationen48 und für Berechnungen des chemischen Potenzials eine vielversprechende Richtung zu sein. Als ersten Test dieser Idee haben wir den \({B}_{2}\)-Wert berechnet, indem wir über mehrere Strukturen aus der PDB für ein gegebenes γ-Kristallin gemittelt haben (Ergänzende Anmerkung 1 und ergänzende Abbildung 11). Diese durchschnittlichen \({B}_{2}\)-Werte zeigen die erwartete Lücke zwischen der Gruppe mit niedrigem und hohem Tc-Wert, jetzt mit einem höheren Konfidenzniveau, da sie auf mehreren Strukturen basiert.

Die Strukturen der γ-Kristalline stammen aus den PDB-Einträgen 1AMM für Rinder-γB49 und 1A45 für Rinder-γF15. PDB2PQR50 wurde verwendet, um Wasserstoffe hinzuzufügen und AMBER-Ladungen zuzuweisen, wobei die Protonierungszustände gemäß PROPKA51 bei pH 7 zugewiesen wurden. Die Nettoladung beträgt 0 für γB und +1 für γF. Darüber hinaus wurden 13 weitere hochauflösende (2,3 Å oder besser) γ-Kristallin-Röntgenstrukturen aus der PDB heruntergeladen und auf ähnliche Weise verarbeitet (siehe Abb. 7 für PDB-Namen). Die S130W-Mutation von γB wurde modelliert, indem die Seitenkette von Trp130 in γF nach Strukturausrichtung unter Verwendung aller Rückgratatome gepfropft wurde. Die neu eingeführte Trp130-Seitenkette kollidierte mit der nahegelegenen Arg147-Seitenkette, und so wurden diese beiden Seitenketten durch Minimierung der steilsten Abstiegsenergie in UCSF Chimera52 verfeinert. Die W130S-Mutation von γF wurde ähnlich modelliert. Vier der fünf menschlichen γD-Strukturen (außer 1HK0) enthielten Einzel- oder Doppelmutationen; Jede der mutierten Seitenketten wurde in die Wildtyp-Seitenkette zurückverwandelt, indem die entsprechende Seitenkette in 1HK0 gepfropft wurde (nach Strukturausrichtung unter Verwendung von Rückgratatomen des betreffenden Rests plus zwei benachbarten Resten in beide Richtungen) und anschließende Energieminimierung. Sofern nicht anders angegeben, betrug die Ionenstärke 0,24 M, basierend auf 100 mM Phosphatpuffer bei pH 7,1 in experimentellen Studien zur Phasentrennung von γ-Kristallin19.

Die Simulation des Diffusionsassoziationspakets (SDA, Version 7.2.2)35 wurde verwendet, um Proteinkonfigurationen bei mehreren Konzentrationen zu erzeugen. Die Simulationsbox war ein Würfel mit einer Seitenlänge von 324 Å; Es wurden periodische Randbedingungen vorgegeben. Die Anzahl (N) der Proteine ​​in der Box betrug 30 oder ein höheres Vielfaches bis hin zu 450 und deckte einen Konzentrationsbereich von 31–461 mg/ml ab. Für die anfänglichen Konfigurationen wurden die Proteinmoleküle zufällig ausgerichtet und an den Positionen von Lennard-Jones-Partikeln aus früheren Simulationen platziert29. Die aus der Lösung der Poisson-Boltzmann-Gleichung (mit der Van-der-Waals-Oberfläche als dielektrische Grenze) mithilfe von APBS53 abgeleiteten effektiven Ladungen wurden für die Berechnung der elektrostatischen Solvatationsenergie54 verwendet. Die Temperatur betrug 300 K. Die Wechselwirkungsenergie zwischen Proteinmolekülen besteht aus Coulomb-Wechselwirkung, elektrostatischer Solvatation, hydrophober Solvatation und Weichkernabstoßung. Mit Ausnahme des letzten Termes, für den wir den Skalierungsfaktor um das Vierfache reduziert haben (von 0,0156 auf 0,0039), wurden Standardparameterwerte verwendet. Der letztgenannte Wert ermöglichte eine gute Übereinstimmung mit FMAPB2 in Paarkorrelationsfunktionen (ergänzende Abbildung 3).

Nach 1 μs Äquilibrierung wurden Schnappschüsse in 10-ns-Intervallen für die nächsten 20 μs gesammelt, was insgesamt 2000 Schnappschüsse ergab. Abhängig von der Proteinzahl N dauerten die BD-Simulationen 5–330 Stunden auf 16 Kernen in zwei Intel(R) Xeon(R) CPU E5-2650 2,6 GHz CPUs.

Die Wechselwirkungsenergiefunktion wird durch die Gleichungen spezifiziert. [4] bis [7]. Für die Berechnung der Wechselwirkungen zwischen zwei Atomen wurde ein Grenzwert von 12 Å festgelegt. Für eine gegebene Konfiguration \({{{{\bf{X}}}}}}\) der Proteinlösung und eine gegebene Orientierung \({{{{{\boldsymbol{\Omega }}}}}}\ ) des Testproteins, die Wechselwirkungsenergie \(U\left({{{{\bf{X}}}}}},\,{{{{{\boldsymbol{\Omega }}}}}}{ {{{{\boldsymbol{,}}}}}}\,{{{{\bf{R}}}}}}\right)\) beim Platzieren der Position \({{{{{\bf{ R}}}}}}\) des Testproteins an einem der 5403 = 1,57464 × 108 Punkte auf einem kubischen Gitter wurde mit FMAP29,32,34 berechnet. Für jede Proteinkonzentration wurde die Berechnung 2000 × 500 = 106 Mal wiederholt, wobei 2000 Proteinkonfigurationen mit 500 Orientierungen des Testproteins kombiniert wurden. Diese Berechnungen dauerten etwa 3500 Stunden pro Proteinkonzentration auf 16 Kernen in zwei Intel(R) Xeon(R) E5-2650 2,6 GHz CPUs. Das überschüssige chemische Potenzial wird abschließend nach Gl. bestimmt. [3].

Für ein gegebenes \({{{{\bf{X}}}}}}\) und ein gegebenes \({{{{{\boldsymbol{\Omega }}}}}}\) gibt FMAP die Zahl zurück von Gitterpunkten, an denen das Testprotein sterische Kollisionen erfährt, und der Wechselwirkungsenergien an allen kollisionsfreien Gitterpunkten. Die letztgenannten Gitterpunkte bilden den kollisionsfreien Bruch \({f}_{{{{{\rm{CF}}}}}}}\). Der Wert von \({f}_{{{{{{\rm{CF}}}}}}}\) ist sehr stabil in Bezug auf die Änderung von \({{{{{\bf{X}} }}}}\) oder \({{{{{\boldsymbol{\Omega }}}}}}\)55\({{{{{\rm{;}}}}}}\) also können wir Behandeln Sie \({f}_{{{{{{\rm{CF}}}}}}}\) als Konstante und bündeln Sie die kollisionsfreien Wechselwirkungsenergien aus den 106 Kombinationen von \({{{{{\ bf{X}}}}}}\) und \({{{{{\boldsymbol{\Omega }}}}}}\), was zu

wobei \({M}_{{{{{{\rm{CF}}}}}}}\) die Gesamtzahl der kollisionsfreien Wechselwirkungsenergien ist. Der maximal mögliche Wert von \({M}_{{{{{\rm{CF}}}}}}}\) beträgt 1,57464 × 1014. Wir bezeichnen diese Formulierung des überschüssigen chemischen Potenzials als „Rohsumme“. “. Im hypothetischen Grenzwert von T → ∞ können wir \(\beta\) auf der rechten Seite von Gleichung auf 0 setzen. [8] und erhalten

Für die Bestimmung des Binodals werden Ergebnisse für \({\mu }_{{{{{{\rm{ex}}}}}}}\) über einen Temperaturbereich benötigt. Anstatt die obigen FMAPμ-Berechnungen bei verschiedenen Temperaturen zu wiederholen, haben wir die Wechselwirkungsenergien einmal bei 298 K berechnet und dann lediglich \(\beta\) geändert, als wir die Summe über die Boltzmann-Faktoren durchgeführt haben (Gl. [8]). Bei dieser Abkürzung wird davon ausgegangen, dass die Wechselwirkungsenergiefunktion temperaturunabhängig ist und dass dieselben BD-Konfigurationen für FMAPμ-Berechnungen bei unterschiedlichen Temperaturen verwendet werden können.

Wir haben die einzelnen Wechselwirkungsenergien, die insgesamt bis zu 1,6 × 1014 betragen können, nicht gespeichert, sondern sie in einem Histogramm in sehr feine Klassen eingeteilt (Breite \(\Delta\) bei 0,016 kcal/mol). Wir haben alle Konfigurationen mit Wechselwirkungsenergien unter −8 kcal/mol für die weitere Analyse gespeichert. Die Rohsumme in Gl. [8] kann nun ausgedrückt werden als

wobei \(H(U)\) die Anzahl der Wechselwirkungsenergien im bei \(U\) zentrierten Behälter ist; und \({U}_{{{\min }}}\) und \({U}_{{{\max }}}\) sind jeweils die minimale und maximale Wechselwirkungsenergie. Beachten Sie, dass der Boltzmann-Faktor \({e}^{-\beta U}\) eine abnehmende Funktion von \(U\) ist, während \(H(U)\) voraussichtlich eine wachsende Funktion von \(U\) ist ), wenn \(U\) von \({U}_{{{\min }}}\ ansteigt. Abhängig davon, ob die Zerfallsrate niedriger oder höher als die Wachstumsrate ist, ist das Produkt \(H(U){e}^{-\beta U}\) entweder eine wachsende oder eine abfallende Funktion von \(U \). Die Zerfallsgeschwindigkeit von \({e}^{-\beta U}\) hängt von der Temperatur ab. Für hohe Temperaturen ist \(H(U){e}^{-\beta U}\) eine wachsende Funktion von \(U\); daher tragen seine Werte bei \(U\) in der Nähe von \({U}_{{{\min }}}\) wenig zur Summe in Gleichung bei. [10] und die Ungenauigkeit in \(H(U)\) in der Nähe von \({U}_{{{\min }}}\) verursacht keine schwerwiegenden numerischen Fehler in \({\mu }_{{{{ {{\rm{ex}}}}}}}\). Bei niedrigen Temperaturen ist \(H(U){e}^{-\beta U}\) jedoch eine zerfallende Funktion von \(U\); dann kann diese Ungenauigkeit in \(H(U)\) zu erheblichen Unsicherheiten in \({\mu }_{{{{{{\rm{ex}}}}}}}\ führen, wie das Ergebnis zeigt für γB bei 277 mg/ml und –2 °C (Abb. 2b).

Wir haben nicht nur die gesamten Wechselwirkungsenergien, sondern auch die einzelnen Terme (z. B. unpolare Anziehung und Elektrostatik) in Histogrammform gespeichert. Mithilfe dieser Daten konnten wir schnell chemische Potentiale und andere Ergebnisse erstellen, wenn wir die Werte der Skalierungsfaktoren \({s}_{1}\) und \({s}_{2}\) änderten.

Um die oben genannten Unsicherheiten in \({\mu }_{{{{{\rm{ex}}}}}}}\ zu mildern, haben wir \(H(U)\) im Bereich niedriger Wechselwirkungsenergie modelliert. Wir haben beobachtet, dass die (nicht normalisierte) kumulative Verteilungsfunktion (CDF)

hat eine exponentielle Abhängigkeit von der Wechselwirkungsenergie (z. B. ergänzende Abb. 5a, b)

für über 10 Größenordnungen, was nahezu den gesamten negativen Bereich von \(U\) abdeckt. Die Werte von \(\alpha\) reichen von 2,1 bis 1,5 (mit zunehmender Proteinkonzentration abnehmend), vergleichbar mit dem Wert von 1,7 von \(\beta\) bei 298 K. Dementsprechend hat die Histogrammfunktion die Form

Eine variable Veränderung

verwandelt \(H\left(U\right)\) in eine Potenzgesetzverteilung:

Wo

ist die Obergrenze von \(x\) in der Potenzgesetzverteilung.

Anstatt eine exakte Potenzgesetzverteilung in \(x\) zu verwenden, passen wir den Logarithmus des CDF an eine lineare Funktion von \(U\) an, indem wir das lokale lineare Regressionsprogramm loess im R-Paket verwenden (http://cran. r-project.org/; mit Grad = 1 für lineare Regression und Spanne = 0,75 als Bruchteil der Datenpunkte für lokal gewichtete Anpassung). Die Anpassung war auf einen Teil des CDF beschränkt, der unten durch CDF = 104 und oben durch \(U\) = −4 kcal/mol begrenzt ist (ergänzende Abbildung 5a, b). Die Fit-Funktion wurde dann auf \(U={U}_{\min }\) extrapoliert. Als nächstes wird die Bestimmung von \({U}_{\min }\) beschrieben.

Eine mögliche Schätzung für \({U}_{\min }\) ist die beobachtete niedrigste Wechselwirkungsenergie, eine solche Schätzung unterliegt jedoch erheblichen statistischen Unsicherheiten. Kürzlich wurde eine robustere Methode zur Schätzung der Obergrenze \(b\) (gleich dem Boltzmann-Faktor von \({U}_{\min }\)) in einer Potenzgesetzverteilung entwickelt36. Bei dieser Methode berechnet man den Mittelwert des größten beobachteten \(x\) unter Replikatstichproben einer bestimmten Größe und passt dann die Abhängigkeit des größten Mittelwerts von der Stichprobengröße an eine Funktion an.

Um diese Methode anzuwenden, haben wir die vollständige Liste der kollisionsfreien Wechselwirkungsenergien in Blöcke unterteilt, von denen jeder aus einer festen Zahl (\({M}_{{{{{{\rm{ori}}}}} }}\)) der Testproteinorientierungen. Jeder Block ist eine Replikatprobe. Die Blockgröße \({M}_{{{{{{\rm{ori}}}}}}}\) ist effektiv ein Maß für die Stichprobengröße; Die Anzahl der Wechselwirkungsenergien für eine einzelne Testproteinorientierung beträgt tatsächlich bis zu 2000 × 1,57464 × 108 = 3,1 × 1011. Die Gesamtzahl der Orientierungen in unseren Berechnungen betrug 500 (bezeichnet als \({M}_{{{{{ {\rm{tot}}}}}}}\)); \({M}_{{{{{{\rm{ori}}}}}}}\) könnte jeder Faktor von \({M}_{{{{{{\rm{tot}}}} sein }}}\), einschließlich 1, 2, 4, 5, 10, 20, 25, 50, 100, 125, 250, 500. Die Anzahl der Blöcke oder Replikatproben betrug dann \({M}_{{ {{{{\rm{rep}}}}}}}={M}_{{{{{{\rm{tot}}}}}}}/{M}_{{{{{{\rm {ori}}}}}}}\). Für jeden Block wurde die niedrigste Wechselwirkungsenergie gefunden; Der Durchschnitt der blockspezifisch niedrigsten Wechselwirkungsenergien wurde dann ausgewertet, um die mittlere niedrigste Wechselwirkungsenergie \({\widehat{U}}_{\min }\) für eine gegebene Blockgröße \({M}_{ {{{{{\rm{ori}}}}}}}\). Die Abhängigkeit von \({\widehat{U}}_{\min }\) von \({M}_{{{{{\rm{ori}}}}}}}\) wurde schließlich angepasst

wobei \({U}_{\min }\), \(D\), \(E\) und \(\delta\) Anpassungsparameter sind, wobei \(\delta\) auf [0,6. 1]36. Um Variationen in den Anpassungswerten von \({U}_{\min }\) zu reduzieren, passen wir gleichzeitig die \({\widehat{U}}_{\min }\)-Daten eines Proteins bei unterschiedlichen Konzentrationen an Gl . [17] und \(D\) als globalen Parameter behandelt. Die Anpassung erfolgte durch Aufruf der Funktion „least_squares“ in scipy (https://scipy.org/), wobei der Trust-Region-Reflexionsalgorithmus als Minimierungsmethode diente. Zusätzlich zur Ermittlung von \({\widehat{U}}_{\min }\) aus der FMAP-Ausgabe haben wir auch die 50 Konfigurationen mit den niedrigsten FMAP-Wechselwirkungsenergien aus jeder Testproteinorientierung genommen und die genauen Wechselwirkungsenergien neu berechnet eine atombasierte Methode56, wodurch ein zweiter Satz von \({\widehat{U}}_{\min }\)-Ergebnissen entsteht. Die Anpassung an Gl. [17] ist in der ergänzenden Abbildung 6 dargestellt. Die resultierenden \({U}_{\min }\)-Werte sind in der ergänzenden Abbildung 5c, d dargestellt, wo man sehen kann, dass die FMAP- und atombasierten Methoden sehr gute Ergebnisse lieferten ähnliche Ergebnisse.

Um \({U}_{\min }\) als Funktion der Proteinkonzentration weiter zu glätten, haben wir angenommen, dass der Endpunkt der CDF-Extrapolation die folgende Abhängigkeit von der kollisionsfreien Fraktion bei der gegebenen Proteinkonzentration aufweist:

Mit dem gewählten Koeffizienten \(B\) zu 1 und dem gewählten Exponenten \(\gamma\) zu 0,25 ergibt Gl. [18] modelliert die gemäß Gl. erhaltenen \({U}_{\min }\)-Ergebnisse genau. [17], wie in der ergänzenden Abbildung 5c, d gezeigt. Also verwendeten wir schließlich Gl. [18] um \({U}_{\min }\)-Werte zum Beenden der CDF-Extrapolation zu bestimmen. Das resultierende \({\mu }_{{{{{\rm{ex}}}}}}}\) ist nun eine glatte Funktion der Proteinkonzentration (z. B. Abb. 3a), frei von verursachten großen Variationen durch eine einzige äußere niedrige Wechselwirkungsenergie. Solche Ausreißer können durch eine große Abweichung (> 1,0 kcal/mol) vom erwarteten \(U\) identifiziert werden, wenn die Anpassungsfunktion für den CDF auf CDF = 1 extrapoliert wird (ergänzender Einschub in Abb. 5b). Die nach Gl. erhaltenen \({U}_{\min }\)-Werte [17] in Fällen mit solchen Ausreißern werden in der ergänzenden Abbildung 5c ​​als offene Symbole angezeigt.

Kurz gesagt, wir haben die lokale lineare Regression auf einen Teil des CDF (über CDF = 104) angewendet und dann bis zur unteren Grenze nach Gl. extrapoliert. [18]. Bei der Berechnung von \({\mu }_{{{{{{\rm{ex}}}}}}}\) wurde der extrapolierte CDF zwischen der Untergrenze und CDF = 104 verwendet, oben wurde jedoch der ursprüngliche CDF verwendet CDF = 104.

Sobald \({\mu }_{{{{{{\rm{ex}}}}}}}\) wie oben beschrieben für einen Bereich von Proteinkonzentrationen bei einer bestimmten Temperatur berechnet wurde, passen wir es an ein Fünftel an. Ordnungspolynom29:

Diese Passform erleichtert die Bestimmung von Binodale und Spinodale. Gleichung [19] ist eine verkürzte Taylor-Entwicklung; Bei einer vollständigen Expansion (bezogen auf die viriale Expansion des osmotischen Drucks) ist der Koeffizient erster Ordnung, \({b}_{1}\), doppelt so groß wie der zweite Virialkoeffizient \({B}_{2}\ ). Durch Addition des Idealteils (Gl. [1] und [2]) erhält man das volle chemische Potenzial \(\mu\).

Unterhalb der kritischen Temperatur enthält die Abhängigkeit von \(\mu\) von \(\rho\) einen nichtmonotonen Teil (bekannt als Van-der-Waals-Schleife) für endlich große Systeme wie die hier modellierten Proteinlösungen (siehe Abb. 3b). Eine horizontale Linie, die die Van-der-Waals-Schleife mit gleichen Flächen unten und oben halbiert (Flächengleichheitskonstruktion), ergibt die Konzentrationen des Proteins in zwei koexistierenden Phasen. Das heißt, die inneren und äußeren Schnittpunkte definieren die Konzentrationen in der verdünnten bzw. dichten Phase. Durch Verknüpfen der Koexistenzkonzentrationen bei einer Reihe von Temperaturen erhält man die Binodale. Darüber hinaus definieren die Konzentrationen an den beiden Extrema der Van-der-Waals-Schleife die Grenzen eines Konzentrationsbereichs, in dem das System thermodynamisch instabil ist. Durch Verknüpfen der Extremwertkonzentrationen bei einer Reihe von Temperaturen erhält man die Spinodale.

Weitere Einzelheiten zur Polynomanpassung und zur flächentreuen Konstruktion finden Sie in Lit. 32. Ein Webserver, der diese Schritte implementiert, befindet sich unter https://zhougroup-uic.github.io/LLPS/.

Der zweite Virialkoeffizient \({B}_{2}\) wird durch die Wechselwirkungsenergie zwischen einem Proteinmolekülpaar bestimmt. Sei \({U}_{1}\left({{{{{\bf{R}}}}}},{{{{{\boldsymbol{\Omega }}}}}}\right)\) sei die Paarwechselwirkungsenergie, dann30

wobei \(V\) das Volumen ist, in dem der Durchschnitt über \({{{{\bf{R}}}}}}\) durchgeführt wird, und \(f\left({{{{{\ bf{R}}}}}},{{{{{\boldsymbol{\Omega }}}}}}\right)\) ist die Mayer-Funktion:

Wir haben \({B}_{2}\) auch mit einer FFT-basierten Methode namens FMAPB230 berechnet. Der Aufbau von FMAPB2 ist identisch mit dem von FMAPμ, allerdings enthält die periodische Box nun ein einzelnes Molekül, also die zentrale Kopie. Die Wechselwirkungsenergiefunktion (siehe Gleichungen [4] bis [7]) und andere Details von FMAPB2 sind mit den folgenden Ausnahmen dieselben wie oben für FMAPμ-Berechnungen beschrieben. Die Seitenlänge des Periodenkastens betrug ~200 Å. Die Testproteinorientierungen wurden aus 68.760 Rotationsmatrizen generiert, die den gesamten Orientierungsraum gleichmäßig und deterministisch abtasten, mit einem Winkel von 6° zwischen aufeinanderfolgenden Rotationsmatrizen57. Die große Anzahl an Testproteinorientierungen macht die \({B}_{2}\)-Ergebnisse sehr robust (mit einem Unterschied von 3 % in γB \({B}_{2}\) bei 25 °C während des Tests Der Proteinorientierungsraum wurde in 4°-Intervallen abgetastet, was 232.020 Rotationsmatrizen umfasste. Zusätzlich zum Histogramm der Paarwechselwirkungsenergien wurden Konfigurationen mit Wechselwirkungsenergien von weniger als -6 kcal/mol zur weiteren Analyse gespeichert.

Wir haben die paarweisen intermolekularen Wechselwirkungen der 1000 Konfigurationen mit der niedrigsten Energie mithilfe der atombasierten Methode weiter analysiert. Insbesondere wurde die Paarwechselwirkungsenergie in die Beiträge der einzelnen Reste des Testproteins zerlegt, die mit der gesamten zentralen Kopie interagieren. Da es sich bei dem Testprotein und der zentralen Kopie um die gleichen Moleküle handelt, führten wir die Zerlegung auch in umgekehrter Weise durch, d. h. indem wir die zentrale Kopie in einzelne Reste zerlegten und das Testprotein als Ganzes behandelten. Für einen gegebenen Rückstand wurden die Ergebnisse zunächst über die 1000 Konfigurationen mit der niedrigsten Energie und dann über diese beiden Zersetzungsarten gemittelt.

Wir haben die 1000 Konfigurationen mit der niedrigsten Energie geclustert, indem wir den Liganden-RMSD als Abstandsmaß verwendet haben. Ligand-RMSD ist die quadratische Mittelwertabweichung zwischen zwei Posen des Testproteins nach Überlagerung mit der zentralen Kopie. Wir haben einen Ligand-RMSD-Grenzwert von 10 Å verwendet, um Cluster zu definieren. In jedem Cluster haben alle Mitglieder Liganden-RMSDs ≤ dem Cutoff eines Mitglieds.

Wir haben RosettaDock47 (Rosetta Version 3.13; https://www.rosettacommons.org/) für die 1000 Posen mit der niedrigsten Energie aus FMAPB2-Berechnungen für γB und γF verwendet. Wir wollten zunächst sehen, wie die Rosetta-Energiefunktion für alle Atome46 γF von γB in der Paarwechselwirkungsenergie trennen kann. Zu diesem Zweck haben wir eine einzelne Runde der Energieminimierung angewendet (Option -dock_min) und die resultierenden Paarwechselwirkungsenergien gespeichert.

Wir wollten dann sehen, wie sich das Umpacken der Seitenketten auf die Paarwechselwirkungsenergien auswirken kann. Zu diesem Zweck führten wir eine Verfeinerung der energieminimierten Posen durch, indem wir Translation und Rotation verhinderten (Bewegungsgrößen auf 0 gesetzt), aber ein Umpacken der Seitenkette ermöglichten (Option -use_input_sc und Optionen -ex1 und -ex2aro, empfohlen von Rosetta). Bis zu zehn Versuche zum Umpacken der Seitenkette wurden durchgeführt, um eine negative Wechselwirkungsenergie zu erhalten. Waren die Wechselwirkungsenergien bei allen zehn Versuchen positiv, wurde der Wert vom letzten Versuch gespeichert.

Als weitere Option zur Modellierung der Proteinflexibilität in \({B}_{2}\)-Berechnungen haben wir der zentralen Kopie und dem Testprotein jede Probe einer vorgewählten Bibliothek von n Strukturen hinzugefügt, was zu n × n Strukturpaaren führte. Für jedes Paar wurde eine Berechnung mit FMAPB2339 durchgeführt, das mit FMAPB230 identisch ist, außer dass die zentrale Kopie und das Testprotein unterschiedliche Strukturen annehmen durften. Der endgültige Durchschnitt \({B}_{2}\) wurde als arithmetisches Mittel der n × n FMAPB23-Ergebnisse verwendet. Für jedes einzelne γ-Kristallin (z. B. Ratten-γE) bestand die Bibliothek aus allen hochauflösenden Röntgenstrukturen in der PDB; Alle verarbeiteten Strukturen enthielten die Reste 1–174 (Rinder-γB-Nummerierung) und dieselbe Sequenz.

Es gibt 12 Sequenzen in der Gruppe mit niedrigem Tc-Gehalt und 3 Sequenzen in der Gruppe mit hohem Tc-Gehalt (ergänzende Abbildung 1a); entsprechend gibt es 66 Grantham-Abstände in der Gruppe mit niedrigem Tc, 3 solcher Abstände in der Gruppe mit hohem Tc und 36 solcher Abstände zwischen den beiden Gruppen an jeder Position entlang der Sequenz. Wir berechneten zunächst die Mittelwerte der gruppeninternen oder gruppeninternen Abstände und subtrahierten dann den größeren der beiden gruppeninternen durchschnittlichen Abstände vom durchschnittlichen gruppeninternen Abstand, was den verbleibenden Grantham-Abstand zwischen den Gruppen ergab. Gln83 von γB richtet sich nach einer Lücke in 11 der 15 Sequenzen; Wir setzen die verbleibende Grantham-Distanz an dieser Position auf 0.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel (und seinen ergänzenden Datendateien) enthalten. Die Quelldaten für alle in Zahlen dargestellten Diagramme sind in GitHub unter https://github.com/hzhou43/g-crystallins hinterlegt.

Datenanalyseverfahren wurden unter Computermethoden beschrieben. Beispielcodes zur Berechnung chemischer Potenziale durch FMAP sind unter https://github.com/hzhou43/MiMB_simulations/tree/main/FMAP hinterlegt. Ein Webserver zur Generierung von Binodalen aus chemischen Potentialen befindet sich unter https://zhougroup-uic.github.io/LLPS/.

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Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Grant GM118091 unterstützt.

Fakultät für Chemie, University of Illinois Chicago, Chicago, IL, 60607, USA

Sanbo Qin & Huan-Xiang Zhou

Fachbereich Physik, University of Illinois Chicago, Chicago, IL, 60607, USA

Huan-Xiang Zhou

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SQ und HXZ entwarfen Forschungsarbeiten, führten Forschungsarbeiten durch, analysierten Daten und verfassten Manuskripte.

Korrespondenz mit Huan-Xiang Zhou.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Marina Guenza und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur: Gene Chong. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Qin, S., Zhou, HX. Die atomistische Modellierung des Flüssig-Flüssig-Phasengleichgewichts erklärt die Abhängigkeit der kritischen Temperatur von der γ-Kristallinsequenz. Commun Biol 6, 886 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05270-7

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Eingegangen: 02. Mai 2023

Angenommen: 22. August 2023

Veröffentlicht: 29. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05270-7

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